新疆是我国传统的五大牧区之一，拥有丰富的牧业资源，具有地方多年培育的优势畜牧品种，伊犁马是其中之一^[1-2]。新疆的马存栏及马肉产量在全国马产业中占有重要地位^[3]，据新疆统计年鉴记载，2018年新疆的马存栏数68.61万匹、肉类产量6.17万吨^[4]，按马骨占酮体20%~25%算，可利用资源相当丰富。伊犁马是我国主要乳肉兼用型马品种，其副产物骨髓具有较好的开发前景。马骨中蛋白质和各类矿物质含量较高，显出多种生物活性^[5-6]。有报道显示，马骨富含胶原蛋白、苹果酸钙等活性物质，且具有较好的抗骨质疏松作用^[7]，但相关构效关系和产品研发工作尚处于初级阶段。长期以来，由于对马骨类资源的药用开发和关注程度不足，骨中丰富的蛋白类成分一直未能开发利用，导致资源的浪费^[8]。因此，研究其具有食药保健功能的蛋白类成分、优化制备工艺、鉴定多肽序列及发现新活性多肽对提高马骨的高值化利用和开发新型骨髓蛋白产品，带动地方特种畜产品经济、提升产业链有重要意义。

动物源性蛋白或酶解物因其药理活性强、剂量小、稳定性高、易吸收等特点，是开发各类保健食品或天然抗氧化剂研发的热点^[9-10]。然而，多肽的分离步骤繁琐，在提取分离过程中保持蛋白原有的结构和活性是其纯化、活性研究和结构鉴定的关键^[11]。因此，需要以活性为导向采用适宜的提取方法和结合绿色的分离技术制备蛋白才能顺利进入产业化开发阶段，同时能阐明多肽构效关系。动物源性蛋白的提取方法主要有等电点沉淀法、热压浸提法、酶提法和水提法等^[10-12]。但上述方法均存在一定的弊端，所得的蛋白含量低，生物活性不明显^[13]。动物骨骼化学成分主要以蛋白质、多肽、油脂、矿物质和硫酸软骨素等为主^[14]，其中蛋白含量较高，现代药理研究表明，上述成分具有抗氧化、抗菌、降血压、降血脂、补血、免疫调节及防治骨质疏松等多种生物活性^[15]。目前，对马骨蛋白类成分和活性方面针对性研究较少，影响了马副产物-骨髓类保健功能食品标准化及产业化开发步伐。前期研究显示，马骨髓蛋白和微量元素含量高于马骨^[16]。为此，本实验在前期研究结果的基础上，将马骨质和骨髓分开，以马骨髓为重点，开展提取方法筛选、提取工艺优化试验来建立其蛋白制备工艺技术和评价体系，为动物源性蛋白类物质基础研究方法和制定药材标准提供新思路。

动物骨类蛋白多种生物活性中抗氧化作用较为显著。研究发现动脉粥样硬化、关节炎、帕金森病、癌症、衰老等疾病和促矿物质吸收、免疫调节、抑菌、抗血栓和抗高血压等作用都与体内外活性氧含量高低或生理代谢过程中产生的自由基含量相关^[17-18]。活性蛋白多肽中氨基酸的连接方式及肽的结构特征会影响其活性^[19]。前期研究得出羊骨、牛骨蛋白提取物均具有抗氧化活性^[20-21]，作为同类家畜，马骨是否具有抗氧化活性需要系统的评价。因此，本研究以蛋白浓度和1,1-二苯基-2-三硝基苯（DPPH）自由基清除率为考察指标，采用综合评分结合响应面法筛选马骨髓蛋白最佳提取工艺，通过测定最佳工艺条件下制备的马骨髓蛋白对DPPH·、羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（${\rm{O}}_2^- \cdot$）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基的清除率和总还原能力，研究其体外抗氧化活性，旨在为马骨髓蛋白的进一步分离纯化、结构鉴定和功能因子的开发提供参考。

1.   材料与仪器

1.1   材料与仪器

马骨　购买于乌鲁木齐华凌牛羊肉批发市场D座（防疫 鉴定），经中国科学院新疆生态与地理研究所阿布力米提·阿布都卡迪尔研究员鉴定为“新疆伊犁马骨”，保存于新疆农业大学626生物大分子实验室；牛血清蛋白　E-BC-K318-MElabscience公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）　上海麦克林生化试剂有限公司；Tris-HCl缓冲液（pH8.2 分析纯）　武汉塞维尔生物科技有限公司；邻苯三酚（分析纯）　天津市大茂化学试剂厂；硫酸亚铁、水杨酸、铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）　天津市致远化学试剂有限公司；无水乙醇、三氯乙酸（TCA）、铁氰化钾（均为分析纯）　天津市北辰方正试剂厂；双氧水、乙醇、石油醚、甲醇（均为分析纯）　上海德榜化工有限公司。

DF-101S磁力搅拌器　上海兴创科学仪器设备有限公司；LGJ-12多岐管型真空冷冻干燥机　上海腾方仪器设备有限公司；UV 2550紫外分光光度计　岛津公司；SF-TDL-40D高速离心机　上海菲恰尔分析仪器有限公司。

1.2   实验方法

1.2.1   马骨髓蛋白的提取

马骨预处理：取马骨中的骨髓样品，用蒸馏水冲洗3次，去除碎骨头，加1:5比例液氮粉碎成粉末，骨髓粉末置于烧杯，存于−40 ℃度冰箱，备用。

工艺流程：马骨粉末→溶剂提取（磁力搅拌回流）→分液漏斗分离油水（收集提取物）层→取油层→再提取→合并滤液→ 脱脂（石油醚）→浓缩（1/4）→ 透析（48 h）→冷冻干燥→骨髓蛋白粉

1.2.2   单因素实验

提取溶剂筛选：取三组5 g马骨髓粉末，分别以水、磷酸缓冲溶液（PBS，pH6.6）及Tris-HCl（pH8.2）作为溶剂进行马骨髓蛋白的提取，其中提取温度45 ℃、提取时间2 h、料液比1:20 g/mL，提取次数1次，收集提取液，离心（5000 r/min、10 min），冷冻干燥。以马骨髓蛋白得率、蛋白浓度及DPPH自由基清除率为指标，筛选最佳提取溶剂。

取5 g马骨髓粉末，固定提取时间2 h，提取料液比1:20 g/mL，提取1次，各磁力搅拌1次/2 h。研究不同提取温度 （30、35、 40、45、50 ℃）对马骨髓蛋白浓度及DPPH自由基清除能力的影响。

取5 g马骨髓粉末，固定提取温度50 ℃，提取料液比1:20 g/mL，提取1次，各磁力搅拌1次/2 h。研究不同提取时间 （1、2、3、4、5 h）对马骨髓蛋白浓度及DPPH自由基清除能力的影响。

取5 g马骨髓粉末，固定提取温度50 ℃，提取时间2 h，提取1次，各磁力搅拌1次/2 h。研究不同料液比 （1:10、1:15 、1:20、1:25、1:30 g/mL）对马骨髓蛋白浓度及DPPH自由基清除能力的影响。

取5 g马骨髓粉末，固定提取温度50℃，提取时间2 h，提取料液比1:20 g/mL。研究不同提取次数（1、2、3、4、5次）对马骨髓蛋白浓度及DPPH自由基清除能力的影响。

1.2.3   响应面试验设计

在单因素实验的基础上，根据设计Box-Behnken原理，以提取温度、提取时间、料液比及提取次数为因素，马骨髓蛋白综合得分为响应值设计试验，响应面试验中各因素的水平见表1。

表  1  响应面优化试验因素水平表

Table  1.  Factors and levels of response surface experiment

水平	提取温度（℃）	提取时间（h）	料液比（g/mL）	提取次数（次）
−1	40	1	1:15	1
0	45	2	1:20	2
1	50	3	1:25	3

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1.2.4   蛋白得率的计算

准确称取一定量的马骨髓粉末（m），进行提 取，冻干，得到马骨髓蛋白粉末（M）。根据下式（1）计算粗蛋白得率：

1.2.5   蛋白浓度的测定

蛋白标准曲线的制作：采用BCA法测定蛋白浓度（参照BCA试剂盒说明书），以蛋白质浓度为横坐标(mg/mL)，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。按照浓度与所测吸光度值绘制马骨髓蛋白含量测定标准曲线回归方程为：

Y=−0.1359X^₂+3.1357X+0.03，R²=0.9999。

样品溶液的测定：称取干燥的骨髓蛋白样品，配制质量浓度为1 mg/mL样品溶液，参照BCA试剂盒说明书，测定样品吸光度，根据下式（2）计算马骨髓蛋白含量。

式中：C₁为供试品溶液中的蛋白质浓度（mg/mL）；C₂样品起始浓度（mg/mL）。

1.2.6   综合评分

根据单因素实验结果，以马骨髓蛋白浓度及DPPH自由基清除能力综合评分为考察指标，由于其贡献值大小未知，因此设定总值为 100%，蛋白浓度为主要考察指标占60%，DPPH自由基清除能力为次考察指标占40%。综合得分按式（3）~式（5）计算：

1.2.7   抗氧化活性研究

1.2.7.1   DPPH自由基清除能力的测定

参照文献[22]的方法，并略作修改。各准确吸取不同浓度的样品溶液1 mL于具塞试管中，分别加入1 mL已配制好的DPPH甲醇溶液（0.2 mmol/L），摇匀，置于37 ℃恒温箱恒温30 min，蒸馏水作为参比，用酶标仪在517 nm处测定吸光度。空白组由1 mL的蒸馏水代替样品溶液，以二丁基羟基甲苯（BHT）为阳性对照。马骨髓蛋白对DPPH自由基的清除率按下式（6）计算：

上式中，A₀为空白组吸光度；A₁为样品组吸光度；A₂为对照品组吸光度。

1.2.7.2   ${\rm{O}}_2^- \cdot$清除能力的测定

采用文献[23]方法测定${\rm{O}}_2^- \cdot$清除率，并略作修改。1 mL样品加入2 mL Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH8.2）混匀，25 ℃放置15 min，加入1 mL邻苯三酚-HCl溶液（6 mmoL/L，用10 mmoL/L稀盐酸配制）25 ℃放置4 min，加入0.1 mL 10 moL/L浓盐酸终止反应，320 nm测吸光度。以BHT为阳性对照，空白组用1 mL水代替，测量三次取平均值。马骨髓蛋白对${\rm{O}}_2^- \cdot$清除率按式（6）计算。

1.2.7.3   OH·清除能力的测定

采用文献[24]方法测定OH·清除率。准确吸取不同浓度的样品溶液各1 mL于具塞试管中，分别加入已1 mL配制好的FeSO₄·7H₂O溶液（6 mmoL/L）和1 mL水杨酸-乙醇溶液（6 mmoL/L），混合均匀，加入1 mL质量浓度为0.1%的过氧化氢溶液使反应启动，置于37 ℃恒温箱恒温30 min，蒸馏水作为参比，在510 nm处测量吸光度。空白组用1 mL水代替，测量三次取平均值，以BHT为阳性对照。马骨髓蛋白对OH·清除率按式（5）计算。

1.2.7.4   ABTS自由基清除能力的测定

采用文献[25]方法测定ABTS自由基清除率，并略作修改。准确量取0.4 mL不同浓度的样品溶液于具塞试管中，加入3.6 mL ABTS自由基溶液，混匀，避光反应6 min，于734 nm处测定吸光度。用1 mL蒸馏水代替样品溶液作为空白，取平均值三次，以BHT作为阳性对照。马骨髓蛋白对ABTS自由基清除率按式（7）计算：

式中，A₀空白组吸光度；A₁为样品组吸光度。

1.2.7.5   总还原能力的测定

采用文献[26]方法测定总还原能力。准确量取0.8 mL不同浓度的样品溶液于具塞试管中分别加入0.4 mL的PBS溶液，再加入0.4 mL铁氰化钾溶液（1%），于50 ℃下放置20 min，降温，加入0.4 mL三氯乙酸水溶液（10%），再加入1.6 mL蒸馏水和0.4 m三氯化铁溶液（0.1%），室温放置10 min，700 nm处测量吸光度，以BHT为阳性对照。

1.3   数据处理

所有实验重复3次，实验结果用平均值±标准差表示，用Origin 9.0、SPSS 25.0和Design-Expert 8.0.6 对实验数据进行处理和分析。

2.   结果与分析

2.1   三种不同提取溶剂对马骨髓蛋白的影响

3种不同溶剂提取的马骨髓蛋白得率、蛋白浓度及DPPH自由基清除能力如表2所示，从三种考察指标来看，水提取法所得骨髓蛋白的综合指标明显高于其余2种。因此，考虑成本和操作便捷选用蒸馏水为提取溶剂并进行后续优化。

表  2  三种不同提取溶剂对马骨髓蛋白的影响 (n=3)

Table  2.  Influence of three different extraction solvents on the horse marrow protein (n=3)

提取方法	得率（%）	蛋白浓度（mg/mL）	DPPH·清除率（%）
水提取	17.24±0.32	41.60±0.78	47.57±0.81
PBS提取	17.14±0.24	32.96±0.34	38.88±0.59
Tris-HCl提取	11.42±0.06	39.02±0.41	42.93±0.39

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2.2   单因素对马骨髓蛋白的影响

如图1所示，温度在30~40 ℃时，蛋白浓度与DPPH自由基清除率随温度的升高而升高，当温度在45 ℃时其蛋白浓度呈降低的趋势，但其DPPH自由基清除率逐渐升高至最高值；在50 ℃时蛋白浓度达到最高值，但其DPPH自由基清除率降低。提取温度较低时，马骨髓蛋白浓度较低，蛋白质的抗氧化活性较弱；适当的升高温度能够促进蛋白的溶出，但温度过高使蛋白质的结构被破坏，导致抗氧化活性降低。当提取温度超过45 ℃时，马骨髓蛋白可能变性，从而失去活性。因此，选择45 ℃为响应面提取马骨髓蛋白的中心点。

图  1  温度对马骨髓蛋白浓度和DPPH自由基清除率的影响

Figure  1.  Effects of temperature on the horse marrow protein concentration and DPPH free radical scavenging ability

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如图2所示，提取时间在1~2 h时，马骨髓蛋白浓度及DPPH自由基清除能力随着提取时间的延长而升高；当在3~5 h内其蛋白浓度与DPPH自由基清除率随着提取时间的延长逐渐降低。随着提取时间的延长，蛋白溶出率随之增大，当达到一定程度后，溶液中的蛋白达到饱和，反应完全；提取的时间太长，容易导致蛋白质的降解及抗氧化活性的减弱。当提取时间为2 h时，马骨髓蛋白的浓度及DPPH自由基清除能力均达到最高值。综合考虑，选择2 h 为响应面提取马骨髓蛋白的中心点。

图  2  提取时间对马骨髓蛋白浓度和DPPH自由基清除率的影响

Figure  2.  Effects of extraction time on the horse bone marrow protein concentration and DPPH free radical scavenging ability

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如图3所示，料液比在1:10~1:20 g/mL时，马骨髓蛋白浓度与DPPH自由基清除率逐渐升高，且在1:20 g/mL时达到最高值。当超过1:20 g/mL时，蛋白浓度随着料液比的增加而降低。同样，其对DPPH自由基的清除能力也在1:20 g/mL时达最高值。料液比会影响溶液的黏度和浓度，当料液比较小时，溶液黏度大，蛋白质分子不易扩散，蛋白浓度较小；随着溶剂量的增加，蛋白浓度先增大，到了饱和状态后进一步增加料液比将导致其蛋白浓度及抗氧化活性的降低。因此，选择1:20 g/mL为响应面提取马骨髓蛋白的中心点。

图  3  提取料液比对马骨髓蛋白浓度和DPPH自由基清除率的影响

Figure  3.  Effects of solid-liquid ratio on the horse bone marrow protein concentration and DPPH free radical scavenging ability

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如图4所示，提取次数在1~2次时，其蛋白浓度及DPPH自由基清除率逐渐升高；提取次数3次后，马骨髓蛋白浓度大幅度降低。提取次数对DPPH自由基的清除能力呈现先升高后降低的趋势，并提取2次时达到最高。提取次数过多，可能会导致非蛋白类杂质的一同溶出，导致马骨髓蛋白浓度及DPPH自由基清除能力的减弱。因此，选择2次为响应面提取马骨髓蛋白的中心点。

图  4  提取次数对马骨髓蛋白浓度和DPPH自由基清除率的影响

Figure  4.  Effects of extraction times on the horse bone marrow protein concentration and DPPH free radical scavenging ability

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2.3   响应面分析马骨髓蛋白提取工艺试验结果

2.3.1   响应面法优化实验设计及结果

Box-Behnken试验设计方案和马骨髓蛋白的综合评分数据如表3所示。将表3中各组综合评分数据采用Design Expert软件进行多元回归和二项式分析，建立马骨髓蛋白提取工艺综合评分（Y）对4个因素（A、B、C、D）的二次回归模型Y=89.90−4.98A−1.25B+1.17C−2.18D−5.63AB−3.39AC+4.30AD+2.00BC+1.83CD+18.19A²−7.16B²−1.83C²−2.42D²。

表  3  响应面分析试验结果

Table  3.  Test results of response surface analysis

实验号	A	B	C	D	蛋白浓度（mg/mL)	DPPH·清除能力（%）	综合评分（Y，%）
1	0	0	1	1	70.340	64.546	88.546
2	−1	0	0	−1	66.457	56.164	83.020
3	−1	−1	0	0	48.958	52.302	65.671
4	−1	0	0	1	59.302	40.357	66.954
5	1	1	0	0	36.110	44.790	51.836
6	1	0	0	−1	49.370	47.046	63.102
7	0	−1	0	1	52.380	73.072	77.921
8	1	−1	0	0	56.760	43.341	66.634
9	−1	0	−1	0	65.560	39.403	71.166
10	0	−1	−1	0	78.380	44.294	83.542
11	0	0	−1	1	68.439	50.655	79.504
12	0	1	1	0	67.310	57.514	82.404
13	0	1	0	−1	74.455	43.526	80.152
14	0	−1	0	−1	67.310	62.753	85.272
15	−1	1	0	0	48.120	67.922	73.584
16	0	0	0	0	71.050	68.025	90.987
17	0	0	1	−1	68.430	65.922	87.854
18	0	0	0	0	79.312	54.105	89.618
19	−1	0	1	0	69.310	48.353	78.902
20	0	0	0	0	71.670	64.890	89.742
21	1	0	−1	0	49.730	55.090	67.778
22	0	0	0	0	71.090	65.339	89.547
23	0	1	−1	0	57.340	62.798	77.754
24	1	−1	0	1	43.590	57.653	64.536
25	0	1	0	1	56.230	65.289	78.278
26	1	0	1	0	46.120	49.447	61.958
27	0	0	−1	−1	77.090	50.834	86.146
28	0	0	0	0	73.032	62.600	89.517
29	0	−1	1	0	69.050	51.099	80.209

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方差分析显示（表4），该模型回归极显著（P<0.0001），失拟项不显著（P>0.05），R²=0.9923，说明该模型与试验拟合较好，试验方法可靠，可准确预测试验响应值。该模型中，一次项A、B、C、D，交互项AB、AC、AD、BC、BD、CD，二次项A²、B²、C²、D²的P值均小于0.01，说明上述因素均对响应值有极显著的影响。在试验范围内各因素对响应值的影响大小分别为：A>D>B>C，即提取温度>提取次数>提取时间>料液比。

表  4  回归模型方差分析

Table  4.  Variance analysis for the regression model

方差来源	平方和	自由度（df）	均方	F值	P值
模型	3015.21	14	215.37	128.03	<0.0001
A-提取温度	299.04	1	299.04	177.77	< 0.0001
B-提取时间	18.49	1	18.49	10.99	0.0051
C-料液比	16.29	1	16.29	9.69	0.0076
D-提取次数	61.07	1	61.07	36.31	< 0.0001
AB	134.10	1	134.10	79.72	< 0.0001
AC	45.94	1	45.94	27.31	0.0001
AD	83.19	1	83.19	49.45	< 0.0001
BC	15.93	1	15.93	9.47	0.0082
BD	9.95	1	9.95	5.91	0.0291
CD	13.45	1	13.45	7.99	0.0134
A2	2101.83	1	2101.83	1249.48	< 0.0001
B2	340.84	1	340.84	202.62	< 0.0001
C2	23.91	1	23.91	14.21	0.0021
D2	32.47	1	32.47	19.30	0.0006
残差	23.55	14	1.68
失拟性	21.99	10	2.20	5.65	0.0548
纯误差	1.56	4	0.39
总差	3038.76	28
注: R2=0.9923；校正决定系数 R2 Adj=0.9845。

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2.3.2   双因素间交互作用影响

利用Design Expert软件绘制不同因素间响应面分析图与等高线图。各因素对马骨髓蛋白的影响如下图5～图7所示。等高线的形状及疏密程度表明两因素互作效应的强弱，椭圆形且曲线密集体现其互作效应对响应值的影响显著，若圆形、曲线稀疏则影响不显著。响应曲面的走势及坡度可体现试验因素对响应值的影响，曲面走势越陡峭，表明两因素交互效应对响应值的影响越显著，响应值的改变越敏感；走势越平缓则与之相反。如图所示，提取时间、提取温度及料液比对马骨髓蛋白综合得分的影响均呈现先升高后降低的趋势；而提取次数对马骨髓蛋白综合得分的影响呈现逐渐降低的趋势；同时，如图5～图7所示，各因素的响应面曲线均比较陡峭，呈椭圆形，说明提取时间、提取温度、料液比和提取次数等4因素均对综合评分有显著地影响，结果与回归分析的结果吻合。

图  5  提取温度与提取时间交互作用的响应面图和等高线图

Figure  5.  Response surface map and contour map of interaction between extraction temperature and time

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图  6  液料比与提取温度交互作用的响应面图和等高线图

Figure  6.  Response surface map and contour map of interaction between liquid-solid ratio and temperature

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图  7  提取次数与提取温度交互作用的响应面图和等高线图

Figure  7.  Response surface map and contour map of interaction between extraction times and temperature

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2.3.3   验证实验结果

经Design-Expert优化后的马骨髓蛋白最佳提取工艺为提取温度 43.96 ℃、提取时间1.91 h、料液比1:19.98 g/mL，提取次数1.55次，此条件下马骨髓蛋白综合评分预测值91.0998%。结合试验条件的可行性，将实际操作改良为提取温度45 ℃、提取时间2 h、料液比1:20 g/mL、提取次数2次。该条件下进行三次重复验证实验，取平均值，得马骨髓中蛋白综合评分91.017%（n=3），与预测值相接近，表明该工艺参数准确可靠。

2.4   马骨髓蛋白抗氧化活性分析

如图8所示，马骨髓蛋白对DPPH·具有较强的清除能力。在测定浓度范围内（0.05~0.5 mg/mL），随着蛋白浓度的增加，其清除能力逐渐增强，呈正相关关系。在低浓度时，马骨髓蛋白对DPPH自由基的清除率大于BHT；然而，随着浓度的升高，BHT的清除能力大于马骨髓蛋白。马骨髓蛋白对DPPH自由基的半抑制浓度（IC₅₀）为0.061 mg/mL，BHT对DPPH自由基的IC₅₀值为0.062 mg/mL。以上结果说明白骨髓蛋白具有较强的抗氧化活性。

图  8  马骨髓蛋白对DPPH自由基的清除率

Figure  8.  DPPH free radical scavenging activity of horse bone marrow protein

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如图9所示, 马骨髓蛋白对${\rm{O}}_2^- \cdot$的清除能力随着马骨髓蛋白浓度的升高，其对${\rm{O}}_2^- \cdot$的清除能力逐渐升高，在浓度为0~0.5 mg/mL浓度范围内，清除能力与浓度成良好的剂量关系，但清除率低于BHT。马骨髓蛋白对${\rm{O}}_2^- \cdot$的IC₅₀为0.250 mg/mL，BHT IC₅₀值为0.066mg/mL。当马骨髓蛋白浓度为0.5 mg/mL时，对${\rm{O}}_2^- \cdot$的清除能力为57.68%。

图  9  马骨髓蛋白对${\rm{O}}_2^-$自由基的清除率

Figure  9.  Superoxide free radical scavenging activity of horse bone marrow protein

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如图10所示，马骨髓蛋白对·OH具有较强的清除能力，且在0~0.5 mg/mL范围内，与浓度呈正比关系。马骨髓蛋白对·OH的IC₅₀值为0.067 mg/mL，BHT的IC₅₀值为0.069 mg/mL。在低浓度时（0.025~0.075 mg/mL），马骨髓蛋白对·OH的清除能力高于BHT，以上结果说明马骨髓蛋白具有较强的抗氧化活性。

图  10  马骨髓蛋白对·OH的清除率

Figure  10.  ·OH scavenging activity of horse bone marrow protein

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如图11所示，不同浓度的马骨髓蛋白均对ABTS自由基有清除作用，且在试验浓度（0.025~0.5 mg/mL）范围内呈明显的量效关系，其清除ABTS自由基的能力低于BHT。BHT对ABTS自由基的IC₅₀值为0.105 mg/mL，马骨髓蛋白的IC₅₀值为0.290 mg/mL。

图  11  马骨髓蛋白对ABTS自由基的清除率

Figure  11.  ABTS radical scavenging activity of horse bone marrow protein

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如图12所示，马骨髓蛋白具有一定的总还原能力。在浓度0.1~0.5 mg/mL范围内总还原能力强弱与马骨髓蛋白浓度呈剂量关系，随着浓度的增加，总还原能力逐渐增强。然而，在此浓度测定范围内，马骨髓蛋白的总还原能力弱于BHT。

图  12  马骨髓蛋白总还原能力

Figure  12.  Total reduction capacity of horse bone marrow protein

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3.   讨论

胶原蛋白的提取和利用是畜禽骨营养成分开发研究领域的热点，目前家畜动物胶原蛋白研究主要集中于提取方法优化和活性筛选等方面。水提法所得的牛骨蛋白浓度达64.73 mg/mL^[27]；猪骨蛋白经水解后提取率达28.45%^[28]；凯氏定氮法测出的鹿骨中蛋白质含量为18.0%^[29]；采用胃蛋白酶提取牦牛胶原蛋白，提取率为35.88%^[30]。与本实验结果相比，脱脂后马骨髓水提蛋白浓度略高，但其提取率略低于猪骨、鹿骨和牦牛骨等。由于不同的提取方法可能造成部分蛋白的沉淀，从而影响蛋白含量及得率等。因此，采用低成本、操作简便的水提法提取马骨髓蛋白具有较好的可操作性和产业化应用前景。

抗氧化作用是动物源蛋白类化合物最主要的生物活性之一。本试验通过测定马骨髓蛋白清除DPPH、ABTS、·OH、${\rm{O}}_2^-\cdot$自由基水平及总还原能力评价了其体外抗氧化活性，结果表明马骨髓蛋白具有较强的抗氧化活性。其中，DPPH自由基清除能力明显高于吴晖等^[31]研究的牛骨胶原蛋白肽碱性蛋白酶酶解及姜海洋^[32]等研究的牦牛骨蛋白碱性蛋白酶酶解物；羟自由基清除能力与羊骨、猪骨酶解物相比较强^[33-34]；马骨髓蛋白对超氧阴离子自由基清除能力与羊骨、牛骨酶解物及鹿骨胶原肽相比显出较强的清除能力^[31,33,35]；马骨髓蛋白总还原能力与鹿骨胶原肽相当^[35]，强于牦牛骨酶解物总还原能力^[32]。同时，ABTS自由基清除能力与刘春雷等^[35]研究的碱性蛋白酶酶解法制备的鹿骨胶原肽相比较弱，这可能与不同原料和提取方法所制备的胶原蛋白或肽具有不同的氨基酸组成、序列、分子量、结构及理化特性等有关^[36]。由此可见，与常见动物相比，通过水提所得的马骨髓蛋白显出较强的抗氧化活性，本实验在未采用高温或酶解条件下，避免了高温高压等引起的蛋白结构的破坏及失活，从而保持蛋白原有的结构以及生物活性。然而，现制备的马骨髓蛋白可能是多种肽的混合物，因此，今后需对其通过酶解、多种方法分离纯化、结构鉴定及活性筛选等进行进一步研究。

4.   结论

本文通过响应面法优化马骨髓蛋白最佳提取工艺为提取温度45 ℃、时间2 h、料液比1:20 g/mL、提取次数2次，此条件下，粗蛋白最佳得率达17.24%±0.032%，蛋白浓度达70.40±0.23 mg/mL。抗氧化实验结果说明马骨髓蛋白具有较强的抗氧化能力，其对DPPH·、·OH、${\rm{O}}_2^- \cdot$及ABTS⁺·的IC₅₀值分别为0.061、0.067、0.250和0.290 mg/mL，具有潜在的应用开发价值。后期研究中将对马骨髓蛋白采用酶解或超滤膜、柱层析等现代技术进行分离纯化、结构鉴定、理化性质及抗氧化活性等方面进行深入的系统研究，确定活性肽段序列，阐明其抗氧化作用机理，将为提升马骨髓蛋白功能价值，并为现代动物源性蛋白多肽类保健食品和药物的开发奠定技术和理论基础，对动物副产物产业链的提升方面具有重要的意义。