Study on the Properties of Recombinant Prolyl Endopeptidase from Abalone (Haliotis discus hannai) Muscle
-
摘要: 为研究皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）中脯氨酰内肽酶（Prolyl endopeptidase，Hdh-PEP)的酶学特性与结构特性，利用基因工程技术重组并在大肠杆菌中高效表达了皱纹盘鲍PEP。原核表达的Hdh-PEP分子量为85 kDa，在pH2～6、温度20～60 ℃条件下，Hdh-PEP的表面疏水性明显升高。氨基酸序列同源性分析结果表明，Hdh-PEP催化结构域中有三个高度保守的氨基酸序列：Seq 1：K-D-G-T-K/R-I-P、Seq 2：Y-G-Y-G-G-F和Seq 3：I-R-G-G-E-Y/F。酶动力学研究表明，Hdh-PEP的米氏常数Km为5.32 μmol/L，催化常数kcat值为15.7 s−1。PEP的特异性抑制剂SUAM-14746和ZPP对Hdh-PEP酶活力具有强抑制作用，丝氨酸蛋白酶抑制（PMSF）对Hdh-PEP酶活力也有较大程度的抑制作用。本实验制备了高特异性抗Hdh-PEP多克隆抗体，可检测鲍鱼肌肉中天然PEP的存在情况。Hdh-PEP的体外高效表达和特异性多克隆抗体制备为后续深入研究Hdh-PEP的性质提供了重要参考。Abstract: In order to study the enzymatic characteristics and structure of prolyl endopeptidase from Haliotis discus hannai (Hdh-PEP), recombinant PEP was cloned and highly expressed in E.coli. Hdh-PEP with molecular weight of 85 kDa was successfully purified and its surface hydrophobicity was greatly affected by pH at low value (pH2～6) and temperature (20～60 ℃). Amino acid sequence homology analysis showed that there were three highly conserved sequences in the catalytic domain of Hdh-PEP: Seq 1: K-D-G-T-K/R-I-P, Seq 2: Y-G-Y-G-G-F and Seq 3: I-R-G-G-E-Y/F. Kinetic study revealed that the Km and kcat of Hdh-PEP were 5.32 μmol/L and 15.7 s−1, respectively. Specific inhibitors SUAM-14746 and ZPP of PEP had strong inhibition on Hdh-PEP activity, and serine protease inhibitor (PMSF) also exhibited inhibition. A high specific polyclonal antibody toward Hdh-PEP was prepared which could be applied for the detection of native PEP in abalone muscle. The successful in vitro expression of Hdh-PEP and preparation of a specific polyclonal antibody against Hdh-PEP provided an important reference for subsequent investigation on Hdh-PEP.
-
我国是鲍鱼生产大国，皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）是国产鲍鱼中产量最高的一个品种[1]。鲍鱼的可食用部分（腹足肌肉）富含多种人体必需氨基酸、呈味氨基酸及牛磺酸，深受消费者的青睐[2]。
脯氨酰内肽酶（Prolyl endopeptidase，PEP）广泛存在于动物、植物和微生物体中，是一种高度保守的丝氨酸蛋白酶[3]，能特异性水解含有脯氨酸残基的小肽（<33个氨基酸）[4]。在人体中，PEP通过切割含有脯氨酸残基的神经小肽、激素和各种细胞因子等物质参与多种生理疾病，从而在医学领域引起广泛的关注[5-10]。此外，微生物PEP也被广泛研究并应用于食品的生产和加工领域中[11-13]。近年来，一些学者发现硬骨鱼的各组织中均有PEP存在，并相继从草鱼[14]、鲤鱼[15]、罗非鱼[16]等肌肉组织中分离纯化出了天然PEP。研究表明，PEP在鱼死后胶原蛋白肽的降解中具有重要作用[17-19]。本课题组在前期研究中发现，鲍鱼PEP（Hdh-PEP）在性腺组织中具有较高酶活。然而，Hdh-PEP作为一种重要的内源酶，其生理功能尚不清楚。Hdh-PEP的结构特征、组织分布及酶学性质等的研究以及对其生理功能的研究十分必要。但由于天然PEP在鲍鱼肌肉中含量极低，分离纯化难度大。因此，本文利用基因工程菌株体外高效表达获得重组Hdh-PEP并制备其多克隆抗体，以期为进一步了解该酶的性质和生理功能提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
本实验所用皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai） 平均重量约60 g，购买于厦门市集美菜市场；底物Suc-Gly-Pro-MCA、抑制剂SUAM-14746、ZPP 日本Peptide Institute公司；酵母粉、蛋白胨 英国Oxoid公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、E-64、苯甲脒（Benzamidine）、亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）、卡那霉素（Kana+）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） 美国Sigma公司；蛋白质标准分子量 立陶宛Fermentas。
PT2100组织捣碎机 瑞典Kinematica；Protein A Sepharose亲和层析（BTR202Q-Y1） 中国博尔西；Ni-NTA柱 北京TransGen；FP-8200荧光分光光度计 日本Jasco；荧光定量PCR仪 美国ABI；Avanti JA-26.5高速冷冻离心机 美国Beckman；超声波细胞破碎仪 美国SCONICS；化学发光荧光成像仪 美国AlphaInnotech；微量蛋白核酸测定仪 德国NanoDrop公司。
1.2 实验方法
1.2.1 鲍鱼不同组织中Hdh-PEP酶活力检测
采用荧光底物法检测不同组织中Hdh-PEP酶活力[20-21]。反应体系：取新鲜鲍鱼的腹足触角、肝胰腺、腹足肌肉、鳃、外套膜、性腺和血液各5 g，将各种组织用剪刀剪碎后放入4倍体积的20 mmol/L磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）（pH6.0）进行组织捣碎，8000 r/min，20 min离心后取100 μL上清溶液与850 μL 20 mmol/L PBS（pH6.0）混匀后再加入50 μL浓度为10 μmol/L的底物（Suc-Gly-Pro-MCA），在其最适温度20 ℃[22]下孵育30 min后，加入1.5 mL终止液（甲醇：异丙醇：超纯水，35：30：35（v/v/v））终止反应。空白实验用蒸馏水代替反应体系中的酶液。用荧光分光光度计（FP-8200）在激发波长380 nm和发射波长450 nm下，分别测定反应体系和空白体系的荧光强度I反应和I空白，Hdh-PEP酶活力用ΔI=I反应-I空白表示。
1.2.2 Hdh-PEP的重组表达及纯化
由于天然PEP在鲍鱼组织中含量极低，且分离纯化难度大[23]。因此，利用基因工程技术构建了Hdh-PEP表达菌株[22]。将菌株接种至含有50 μg/mL Kana+的Luria-Bertani液体培养基（1 L），在37 ℃恒温培养箱中，转速200 r/min下培养6 h至OD600值为0.6后，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导剂进行低温低转速（16 ℃，100 r/min，15 h）诱导表达。将诱导后的菌液离心收集（8000 r/min，4 ℃，20 min），弃去上清液后，使用20 mL菌体裂解液（20 mmol/L PBS，10 mmol/L咪唑，1 mmol/L β-巯基乙醇，pH6.0）重悬细菌沉淀。将重悬均匀的细菌悬浮液在冰浴中使用超声波细胞破碎仪进行破碎，然后将全菌液离心（8000 r/min，4 ℃，25 min），取上清。用0.2 μm的聚醚砜膜对上清过滤后，以1 mL/min的流速上样于已用平衡缓冲液（20 mmol/L PBS，10 mmol/L咪唑，pH6.0）处理的Ni-NTA柱。完成上样后，使用流洗缓冲液（20 mmol/L PBS，50 mmol/L咪唑，pH6.0）流洗3 h以除去杂蛋白。换用洗脱缓冲液（20 mmol/L PBS，250 mmol/L咪唑，pH6.0）进行目的蛋白洗脱，使用自动收集器以每管2.5 mL进行收集。纯化得到Hdh-PEP溶液经20 mmol/L PBS（pH6.0）透析以去除咪唑，纯化及透析过程在低温（4 ℃）下进行。
1.2.3 Hdh-PEP纯度及浓度测定
取10 μL Hdh-PEP（1.0 mg/mL）溶液及3 μL蛋白质标准分子量（Marker，26～130 kDa）上样于12%的凝胶进行SDS-PAGE分析，以确定Hdh-PEP的分子量及纯度。Hdh-PEP浓度采用Bradford法进行检测，用PBS缓冲液（pH6.0）配制不同浓度的牛血清白蛋白溶液（100～500 μg/mL），以蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.4 Hdh-PEP酶活力测定
按照1.2.1中荧光底物法检测重组的Hdh-PEP酶活力。
1.2.5 PEP二级结构分析
在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中获得不同物种的PEP氨基酸序列，下载其FASTA格式文件，登录ClustalW在线服务器（http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）进行氨基酸序列比对[24]。使用ESPrint 3.0在线服务器（http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）对ClustalW分析产生的序列比对结果进行二级结构对比分析[25]。
1.2.6 酶动力学参数测定
将50 μL不同浓度的底物（Suc-Gly-Pro-MCA）和50 μL Hdh-PEP（2.5 mg/mL）加入到900 μL磷酸缓冲液（25 mmol/L，pH6.0）中混合均匀后，在20 ℃下反应5 min，加入1.5 mL终止液终止反应，按照1.2.1方法对酶活力进行测定。以1/[S]为横坐标，1/ν为纵坐标，绘制Lineweaver-Burk双倒数图[10]，并计算Hdh-PEP酶动力学参数：米氏常数Km、最大反应速度Vmax和催化常数kcat。
1.2.7 表面疏水性的测定
通过1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalenesulfonic acid，ANS）荧光探针法分析不同pH和温度对酶的表面疏水性的影响。蛋白质的表面疏水性取决于其三级结构中疏水性氨基酸的暴露程度，ANS荧光探针能够高亲和性结合蛋白疏水区，结合后荧光增强[26]，因此，用荧光强度的变化反映蛋白表面疏水性的变化。在96孔酶标板中，向5排反应孔中加入200 μL Hdh-PEP（0.1 mg/mL，pH6.0），再加入4 μL ANS溶液（8 mmol/L），混合均匀后分别在20、30、40、50、60 ℃下避光反应20 min。在另一个96孔酶标板中，向6排反应孔中加入4 μL ANS溶液（8 mmol/L）和200 μL用不同pH（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0）缓冲液配制的Hdh-PEP（0.1 mg/mL）后，混合均匀，于20 ℃下避光反应20 min。使用酶标仪对反应液进行全波长扫描（激发波长：390 nm，发射波长：425～600 nm）以获得荧光光谱值。
1.2.8 抑制剂对Hdh-PEP酶活力的影响
反应体系：将890 μL 25 mmol/L的PBS（pH6.0）中、50 μL Hdh-PEP（2.5 mg/mL）及10 μL不同种类的抑制剂（SUAM-14746、ZPP、PMSF、EDTA、EGTA、E-64、Benzamidine、Leupeptin），抑制剂终浓度分别为5、5、5、2、5、5、1、5 μmol/L。在室温下孵育30 min后，加入50 μL底物（Suc-Gly-Pro-MCA，10 μmol/L），20 ℃下孵育30 min后立即加入1.5 mL终止液终止反应，检测剩余酶活力。空白组样品以蒸馏水代替抑制剂。
1.2.9 兔抗Hdh-PEP多克隆抗体的制备
1.2.9.1 免疫
将纯化后的Hdh-PEP浓度调整至1.0 mg/mL，取200 μL Hdh-PEP（0.2 mg）与等体积的弗氏完全佐剂充分混合后对成年雄兔进行初次免疫，采用皮下多点注射方式[27]。每间隔一周进行三次加强免疫，免疫过程委托厦门大学实验动物中心完成。免疫完成后取少量兔子耳朵动脉血清检测其效价及特异性，达标后进行颈动脉取全血。取得的全血在4 ℃下静止4 h后，在4 ℃、10000 r/min下离心15 min，收集上层血清。
1.2.9.2 多克隆抗体IgG的纯化
采用Protein A Sepharose亲和层析柱对血清中的抗Hdh-PEP多克隆抗体IgG进行纯化[16]。用0.1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液对层析柱进行平衡，取血清与等体积的0.1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液混匀后，上样于亲和层析柱。用10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）进行流洗，直至流洗液A280<0.05，以除去杂蛋白。然后，用0.1 mol/L Glycine-HCl（pH3.0）缓冲液进行洗脱，将纯化得到的IgG进行SDS-PAGE分析。
1.2.9.3 多克隆抗体的特异性分析
采用Western blotting方法对鲍鱼腹足肌肉中的Hdh-PEP进行检测。取5 g新鲜鲍鱼腹足肌肉，加10倍体积的10 mmol/L PBS（pH6.0）进行组织捣碎，10000 r/min离心30 min，取上清。经SDS化后上样于12%的电泳胶，电泳完成后，将蛋白条带转移至硝酸纤维素模（NC膜）上。用5%脱脂奶对NC膜进行封闭，随后进行三次Tris-HCl-吐温-20洗涤缓冲液（TBST）洗膜，每次间隔5 min。用TBST将纯化得到的IgG稀释（1:100000）后作为一抗，与NC膜在室温下轻摇45 min。孵育完成后，用TBST溶液洗涤5次，每次5 min。将NC膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体共孵育45 min后，用TBST溶液充分洗净。将NC膜与ECL显影液反应2 min，使用化学发光荧光成像仪显示结果。
1.3 数据处理
本文中所有数据均为三次重复的平均值，采用Excel2010对数据进行处理并进行误差分析。制图及排版在WPS 2019 PowerPoint和Adobe Illustrator CS5上完成。
2. 结果与分析
2.1 Hdh-PEP在鲍鱼各组织中的酶活分布情况
为了检测鲍鱼各组织中Hdh-PEP的酶活力情况，以Suc-Gly-Pro-MCA为底物，检测鲍鱼7个主要组织（腹足触角、肝胰腺、腹足肌肉、鳃、外套膜、性腺和血液）中Hdh-PEP的酶活。如图1所示，在鲍鱼性腺中Hdh-PEP酶活性最高，肝胰腺、腹足肌肉次之，血液中的酶活力最低。据Ohta等[28]报道，小鼠在发情期子宫和卵巢中的PEP酶活性有显著增加的变化趋势，揭示了卵巢激素循环水平与PEP的活性密切相关。此外，据Yoshida等[29]报道，PEP的特异性抑制剂能抑制鲱鱼精子激活蛋白的酶活力和精子活力。这些研究表明，PEP除了与人的神经退行性疾病相关，也参与其他生物的生殖繁育过程。目前，PEP在贝类动物鲍鱼中的作用尚不清楚，但其在鲍鱼性腺组织中具有较高酶活，因此推测PEP在鲍鱼的生殖繁育过程中发挥重要作用。
![]()
图 1 Hdh-PEP在鲍鱼不同组织中的相对酶活Figure 1. Relative enzymatic activity of Hdh-PEP in different tissues2.2 Hdh-PEP的体外重组表达及纯化
SDS-PAGE分析显示，Hdh-PEP表达菌株经低温培养和诱导表达后，在全菌液中出现了一条明显的蛋白条带（约85 kDa），表明产生了大量重组Hdh-PEP（图2，泳道1），其中一部分以可溶状态存在于上清液中（图2，泳道2），将上清液上样于Ni-NT柱进行纯化后得到单一条带（图2，泳道3），表明重组Hdh-PEP的纯度达到95%以上。从1 L培养液中可纯化得到Hdh-PEP 4.06 mg，总活力26.47 U，比活力为6.52 U/mg。
![]()
图 2 纯化Hdh-PEP的SDS-PAGE分析注：M，标准蛋白；1，表达菌株的全菌液；2，表达菌株的上清液；3，纯化后的Hdh-PEP。Figure 2. SDS-PAGE analysis of purified Hdh-PEP2.3 二级结构差异性分析
为了解不同来源PEP二级结构的差异性，本文中选择了纹缘盔孢伞（Galerina marginata，Gm-PEP）、猪（Porcine，Pc-PEP）、人（Homo sapiens，Hm-PEP）、黄色粘球菌（Myxococcus xanthus，Mx-PEP）四个物种的PEP与Hdh-PEP的氨基酸序列及二级结构进行比较分析。结果如图3所示，在β-螺旋桨结构域（蓝色虚线）中，只有少数氨基酸（红色突出显示）是相同的，而在催化结构域（蓝色实线）中相同的氨基酸数量占比明显较多。其中，在催化结构域中发现三个高度保守的PEP特异性氨基酸序列：Seq 1：K-D-G-T-K/R-I-P、Seq 2：Y-G-Y-G-G-F、Seq 3：I-R-G-G-E-Y/F。这表明，PEP的催化结构域比β-螺旋桨结构域更保守。另外，通过DNAMAN软件计算得到Hdh-PEP与其它4种PEP的氨基酸序列同源性分别为63.80%、63.24%、22.95%和36.12%。图3中10个α-螺旋结构（以黑色线圈表示）分布在催化区域中，28个β-折叠结构（以黑色箭头表示）分布在β-螺旋桨结构域中。尽管它们的氨基酸序列相似性存在较大差异，但二级结构特征是非常相似的。
![]()
图 3 PEP的氨基酸序列和二级结构比对注：1，Hdh-PEP；2，Gm-PEP；3，Pc-PEP；4，Hm-PEP；5，Mx-PEP；蓝色实线，催化结构域；蓝色虚线，β-螺旋桨结构域；红色，保守的氨基酸序列。Figure 3. Amino acid sequence and secondary structure comparison of PEPs2.4 Hdh-PEP酶动力学分析
以Suc-Gly-Pro-MCA为底物，通过动力学方法测定酶分解底物的米氏常数和催化常数。固定酶浓度，选取不同浓度的Suc-Gly-Pro-MCA为底物，测定酶催化底物水解的反应初速率。根据Lineweaver-Burk双倒数作图法，得到图4。由此得出，Hdh-PEP分解该底物的米氏常数Km为5.32 μmol/L，其催化常数kcat值为15.7 s−1。
![]()
图 4 Hdh-PEP的Lineweaver-Burk双倒数图Figure 4. Lineweaver-Burk double reciprocal of Hdh-PEP2.5 Hdh-PEP表面疏水性分析
蛋白质的表面疏水性取决于其三级结构中疏水性氨基酸的暴露程度，因此疏水性的变化可以用来反映蛋白质三级结构的变化。pH和温度是影响蛋白酶催化活性的重要因素之一，因此通过ANS疏水荧光探针法检测了pH和温度对Hdh-PEP表面疏水性的影响，以了解Hdh-PEP的结构稳定性。
如图5A显示，Hdh-PEP在490 nm处出现最大吸收峰，随着pH升高，Hdh-PEP的荧光强度逐渐下降。表明pH越高，Hdh-PEP的表面疏水性越弱。为了进一步研究pH对Hdh-PEP疏水性的影响，检测了不同质量浓度的Hdh-PEP荧光强度的变化（激发波长：390 nm，发射波长：470 nm）。以Hdh-PEP的蛋白浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标进行作图，获得在不同pH下Hdh-PEP的疏水指数（斜率）（图5B）。结果显示，pH<6时，Hdh-PEP的疏水指数较大，而pH>6时，Hdh-PEP的疏水指数较小，表明Hdh-PEP表面疏水性易受低酸性环境（pH<6）的影响，即当pH<6时Hdh-PEP的空间稳定性较差。
![]()
图 5 pH和温度对Hdh-PEP表面疏水性的影响注：A、C，pH和温度对荧光强度的影响；B、D，pH和温度对疏水指数的影响。Figure 5. Effect of pH and temperature on the surface hydrophobicity of Hdh-PEP如图5C所示，随着温度逐渐升高，荧光强度逐渐增强。这可能是高温引起Hdh-PEP三级结构发生变化，更多疏水性氨基酸残基暴露的原因。为了进一步确定温度对Hdh-PEP疏水性的影响，检测了0.01～1.00 mg/mL浓度范围中Hdh-PEP在不同温度下荧光强度的变化。如图5D所示，随着温度的升高，Hdh-PEP的疏水性指数（斜率）逐渐变大，表明温度越高，Hdh-PEP的表面疏水性增加，即空间结构越不稳定。
2.6 不同蛋白酶抑制剂对Hdh-PEP酶活力的影响
将纯化后的重组Hdh-PEP与不同的蛋白酶抑制剂于20 ℃共孵育30 min后，测定重组Hdh-PEP的剩余酶活力，以分析不同蛋白酶抑制剂对Hdh-PEP酶活力的影响。结果如表1所示。
表 1 蛋白酶抑制剂对Hdh-PEP的作用Table 1. Effect of proteinase inhibitors on the activity of Hdh-PEP抑制剂 终浓度（μmol/L） 相对酶活（%） 对照组 0 100.0 SUAM-14746 5 5.7 ZPP 5 6.9 PMSF 5 58.5 EDTA 2 86.9 EGTA 5 98.2 E-64 5 89.5 Benzamidine 1 96.7 Leupeptin 5 94.1 由表1可知，SUAM-14746和ZPP作为PEP的特异性抑制剂对Hdh-PEP酶活力具有较好的抑制作用，抑制率分别为94.3%和93.1%。PMSF是丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂，其对Hdh-PEP酶活力具有一定程度的影响，但抑制率只有41.5%，相对较弱。而其它丝氨酸蛋白酶抑制剂（Benzamidine和Leupeptin）对酶活性几乎无抑制作用。此外，EDTA、EGTA等金属蛋白酶抑制剂以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64对Hdh-PEP酶活力同样几乎无抑制作用。Hdh-PEP与草鱼PEP、鲤鱼PEP相似，均能被丝氨酸蛋白酶抑制剂不同程度地抑制[14, 30]。
2.7 Hdh-PEP多克隆抗体的制备及检测
为了获得特异性及效价良好的Hdh-PEP多克隆抗体，本文制备了兔抗Hdh-PEP多克隆抗体。SDS-PAGE分析表明，经过纯化后的兔血清溶液中显示出50和25 kDa两个条带（图6A），即IgG抗体的重链和轻链。为了检测该多克隆抗体的特异性，将纯化后的IgG作为一抗对鲍鱼腹足肌肉中的天然Hdh-PEP进行Western blotting分析。结果如图6B所示，在72～95 kDa范围内检测到一条清晰的蛋白条带，与Hdh-PEP分子量（85 kDa）接近。该结果表明，兔抗Hdh-PEP多克隆抗体能在鲍鱼肌肉组织粗蛋白上清液中与天然Hdh-PEP特异结合。
![]()
图 6 Hdh-PEP多克隆抗体的SDS-PAGE分析和Hdh-PEP的Western blotting分析注：A，Hdh-PEP多克隆抗体的SDS-PAGE；B，Hdh-PEP的Western blotting分析。泳道M，标准蛋白；1，Hdh-PEP多克隆抗体；2，鲍鱼肌肉蛋白；3，天然Hdh-PEP的Western blotting分析。Figure 6. SDS-PAGE analysis of Hdh-PEP polyclonal antibody and western blotting analysis of Hdh-PEP3. 结论
皱纹盘鲍脯氨酰内肽酶（Hdh-PEP）分布于鲍鱼各组织中，在性腺中酶活力最高，这表明Hdh-PEP与鲍鱼生殖、免疫等生理活动密切相关。重组Hdh-PEP分子质量为85 kDa，比活力为6.52 U/mg。Hdh-PEP与纹缘盔孢伞、猪、人、黄色粘球菌PEP的序列同源性分别为63.80%、63.24%、22.95%和36.12%。从二级结构比对分析结果发现，Hdh-PEP的催化结构域比β-螺旋桨结构域更保守。Hdh-PEP的表面疏水性与pH、温度密切相关，随着pH下降、温度升高，表面疏水性增加，空间结构稳定性下降。与鱼类PEP相似，PEP特异性抑制剂对SUAM、ZPP对Hdh-PEP酶活力抑制率分别为94.3%和93.1%。兔抗Hdh-PEP多克隆抗体可特异检测鲍鱼肌肉蛋白中天然Hdh-PEP的存在，为后续从蛋白水平研究Hdh-PEP提供了条件。
-
![]()
图 1 Hdh-PEP在鲍鱼不同组织中的相对酶活
Figure 1. Relative enzymatic activity of Hdh-PEP in different tissues
![]()
图 2 纯化Hdh-PEP的SDS-PAGE分析
注：M，标准蛋白；1，表达菌株的全菌液；2，表达菌株的上清液；3，纯化后的Hdh-PEP。
Figure 2. SDS-PAGE analysis of purified Hdh-PEP
![]()
图 3 PEP的氨基酸序列和二级结构比对
注：1，Hdh-PEP；2，Gm-PEP；3，Pc-PEP；4，Hm-PEP；5，Mx-PEP；蓝色实线，催化结构域；蓝色虚线，β-螺旋桨结构域；红色，保守的氨基酸序列。
Figure 3. Amino acid sequence and secondary structure comparison of PEPs
![]()
图 4 Hdh-PEP的Lineweaver-Burk双倒数图
Figure 4. Lineweaver-Burk double reciprocal of Hdh-PEP
![]()
图 5 pH和温度对Hdh-PEP表面疏水性的影响
注：A、C，pH和温度对荧光强度的影响；B、D，pH和温度对疏水指数的影响。
Figure 5. Effect of pH and temperature on the surface hydrophobicity of Hdh-PEP
![]()
图 6 Hdh-PEP多克隆抗体的SDS-PAGE分析和Hdh-PEP的Western blotting分析
注：A，Hdh-PEP多克隆抗体的SDS-PAGE；B，Hdh-PEP的Western blotting分析。泳道M，标准蛋白；1，Hdh-PEP多克隆抗体；2，鲍鱼肌肉蛋白；3，天然Hdh-PEP的Western blotting分析。
Figure 6. SDS-PAGE analysis of Hdh-PEP polyclonal antibody and western blotting analysis of Hdh-PEP
表 1 蛋白酶抑制剂对Hdh-PEP的作用
Table 1 Effect of proteinase inhibitors on the activity of Hdh-PEP
抑制剂 终浓度（μmol/L） 相对酶活（%） 对照组 0 100.0 SUAM-14746 5 5.7 ZPP 5 6.9 PMSF 5 58.5 EDTA 2 86.9 EGTA 5 98.2 E-64 5 89.5 Benzamidine 1 96.7 Leupeptin 5 94.1 
下载: 导出CSV
-
[1] 农业农村部渔业渔政管理局, 全国水产技术推广总站, 中国水产学会编制. 中国渔业统计年鉴-2019[M]. 北京: 中国农业出版社, 2019. [2] 朱蓓薇. 海珍品加工理论与技术的研究[M]. 北京: 科学出版社, 2010: 152-158. [3] Yadav P, Goyal V D, Gaur N K, et al. Carboxypeptidase in prolyl oligopeptidase family: Unique enzyme activation and substrate-screening mechanisms[J]. The Journal of Biological Chemistry,2019,294(1):89−100. doi: 10.1074/jbc.RA118.004254
[4] Babkova K, Korabecny J, Soukup O, et al. Prolyl oligopeptidase and its role in the organism: Attention to the most promising and clinically relevant inhibitors[J]. Future Medicinal Chemistry,2017,9(10):1015−1038. doi: 10.4155/fmc-2017-0030
[5] Männistö P T, García-Horsman J A. Mechanism of action of prolyl oligopeptidase (PREP) in degenerative brain diseases: Has peptidase activity only a modulatory role on the interactions of PREP with proteins?[J]. Frontiers in Aging Neuroscience,2017,9:27.
[6] García-Horsman J A, Männistö P T, Venäläinen J I. On the role of prolyl oligopeptidase in health and disease[J]. Neuropeptides,2007,41(1):1−24. doi: 10.1016/j.npep.2006.10.004
[7] Myöhänen T T, Pyykkö E, Männistö P T, et al. Distribution of prolyl oligopeptidase in human peripheral tissues and in ovarian and colorectal tumors[J]. Journal of Histochemistry & Cytochemistry,2012,60(9):706−715.
[8] Venditti M, Aniello F, Santillo A, et al. Study on PREP localization in mouse seminal vesicles and its possible involvement during regulated exocytosis[J]. Zygote (Cambridge, England),2019,27(3):160−165. doi: 10.1017/S0967199419000194
[9] Campbell D J. Neprilysin inhibitors and bradykinin[J]. Frontiers in Medicine,2018,5:257. doi: 10.3389/fmed.2018.00257
[10] Prades R, Munarriz-Cuezva E, Urigüen L, et al. IPR-166: A potent and selective prolyl oligopeptidase inhibitor ameliorates cognitive symptoms associated to schizophrenia after oral administration[J]. European Neuropsychopharmacology,2019,29:S244.
[11] Colgrave M L, Byrne K, Howitt C A. Liquid chromatography-mass spectrometry analysis reveals hydrolyzed gluten in beers crafted to remove gluten[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2017,65(44):9715−9725. doi: 10.1021/acs.jafc.7b03742
[12] Luoto S, Jiang Z Q, Brinck O, et al. Malt hydrolysates for gluten-free applications: Autolytic and proline endopeptidase assisted removal of prolamins from wheat, barley and rye[J]. Journal of Cereal Science,2012,56(2):504−509. doi: 10.1016/j.jcs.2012.06.004
[13] Walter T, Wieser H, Koehler P. Production of gluten-free wheat starch by peptidase treatment[J]. Journal of Cereal Science,2014,60(1):202−209. doi: 10.1016/j.jcs.2014.02.012
[14] 翁凌, 林韵, 张玲, 等. 草鱼肌肉脯氨酸内肽酶的研究[J]. 中国食品学报,2015,15(9):23−31. [15] 王梦想. 鲤鱼肌肉脯氨酸内肽酶的分离纯化及性质分析[D]. 厦门: 集美大学, 2015. [16] 肖琳琳. 罗非鱼和鲈鱼骨骼肌脯氨酸内肽酶的研究[D]. 厦门: 集美大学, 2017. [17] 唐俊, 颜龙杰, 翁凌, 等. 蓝圆鲹骨骼肌脯氨酸内肽酶的分离纯化及其对胶原肽的作用[J]. 现代食品科技,2016,32(6):122−129. [18] 颜龙杰. 刺参(Stichopus japonicas)胶原蛋白及自溶相关蛋白酶的研究[D]. 厦门: 集美大学, 2019. [19] 郑杰, 宋志远,于笛, 等. 水产动物自溶研究进展[J]. 食品工业科技,2015,36(13):397−400. [20] 谢雪琼. 鲢鱼肌肉脯氨酰内肽酶及抑制肽的研究[D]. 厦门: 集美大学, 2019. [21] 肖琳琳, 翁凌, 钟婵, 等. 罗非鱼脯氨酸内肽酶的分离及抑制剂对其的作用机制[J]. 集美大学学报(自然科学版),2017,22(1):10−20. [22] Li W Y, Li Y, Chen Y L, et al. Characterization and crystal structure of prolyl endopeptidase from abalone (Haliotis discus hannai)[J]. Food Chemistry,2020,333:127452. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.127452
[23] 李越. 皱纹盘鲍脯氨酰内肽酶的分子克隆、体外表达及相关性质分析[D]. 厦门: 集美大学, 2018. [24] 杨阳. 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)肌浆蛋白过敏原的致敏性研究[D]. 厦门: 集美大学, 2018. [25] Robert X, Gouet P. Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript server[J]. Nucleic Acids Research,2014,42(W1):W320−W324. doi: 10.1093/nar/gku316
[26] Kato A, Nakai S. Hydrophobicity determined by a fluorescence probe method and its correlation with surface properties of proteins[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure,1980,624(1):13−20. doi: 10.1016/0005-2795(80)90220-2
[27] 邹睿. 贝类副肌球蛋白的分离纯化、性质研究与分子克隆[D]. 厦门: 集美大学, 2019. [28] Ohta N, Takahashi T, Mori T K, et al. Hormonal modulation of prolyl endopeptidase and dipeptidyl peptidase IV activities in the mouse uterus and ovary[J]. Acta Endocrinologica,1992,127(3):262−266. doi: 10.1530/acta.0.1270262
[29] Yoshida K, Inaba K, Ohtake H, et al. Purification and characterization of prolyl endopeptidase from the Pacific herring, Clupea pallasi, and its role in the activation of sperm motility[J]. Development, Growth & Differentiation,1999,41(2):217−225.
[30] Wang M X, Zhong C, Cai Q F, et al. Study on a prolyl endopeptidase from the skeletal muscle of common carp (Cyprinus carpio)[J]. Process Biochemistry,2012,47(12):2211−2218. doi: 10.1016/j.procbio.2012.08.016
-
期刊类型引用(9)
1. 霍善琴，赵新楠，林怡辰，王腾，谭志军，彭吉星. 食品中维生素B分析方法研究进展. 食品与药品. 2025(01): 112-119 . 
百度学术
2. 于瑞莉，任静，华佳淼，邹凤，黄丽俊. 国标法测定特医食品中叶酸的方法研究. 中国标准化. 2024(15): 251-256 . 百度学术
3. 陆伟，王俊，靳利军，熊菲菲，晏永球，贾福怀. 高效液相色谱法测定复合营养素补充剂中叶酸含量. 山东化工. 2023(04): 127-130 . 百度学术
4. 于瑞莉，冯永巍，黄丽俊，杨婷. 特殊食品中3种B族维生素检测方法的研究进展. 食品与药品. 2022(01): 91-96 . 百度学术
5. 王养平，焦建军. 运动营养饼干品质指标的主成分分析及聚类分析. 食品安全质量检测学报. 2022(05): 1405-1413 . 百度学术
6. 苏妙仪，严家俊，张娟. 微生物法检测乳粉中叶酸的优化研究. 中国乳业. 2021(02): 81-85 . 百度学术
7. 涂宏建，陆伟，贾福怀，谢承群，雷蕾，王鹏泽. 涡旋振荡提取-高效液相色谱-紫外检测法测定铁叶酸片中的叶酸含量. 食品安全质量检测学报. 2021(09): 3721-3726 . 百度学术
8. 吴思敏，严家俊，黄钟标. 微生物法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量不确定度评估. 中国乳业. 2021(07): 91-97 . 百度学术
9. 霍艳杰，雷浩，高勤叶，曹晓洁，张晓英，贺习文. 分光光度法测定饲料添加剂叶酸含量的方法研究. 粮油与饲料科技. 2021(05): 30-33 . 百度学术
其他类型引用(0)
下载:
计量
- 文章访问数: 196
- HTML全文浏览量: 93
- PDF下载量: 20
- 被引次数: 9
