花青素（Anthocyanin, ACN）是一类水溶性天然色素，属黄酮类化合物，主要来源于萝卜、爬山虎、紫薯、葡萄、板栗等植物中^[1-3]。花青素是天然抗氧化剂，具有强效抗氧化性，可与生物体内其他分子相互作用而产生抗氧化等功效，减少自由基对人体细胞的伤害，起到抗氧化及抗衰老的作用，从而保护人体免疫系统^[4-7]。有研究表明，花青素有抑菌活性，能影响肠道微生物菌群，可以抑制部分肠道病原菌数量，增加双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌的数目，增强肠道屏障功能，花青素基于天然色素和抗氧化性这两个特性，在医药、食品及化妆品工业均有所应用^[5,7-10]。

牛血清白蛋白（BSA）常用作小分子药物研究的作用靶标，同时基于BSA中三个发射荧光氨基酸残基（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸），ACN与BSA结合，能减缓BSA的氧化进程，从而起到保护BSA的作用^[11]。为了进一步研究ACN与BSA作用机理及对BSA功能构象的影响，本文采用荧光光谱法、紫外-可见光吸收法、圆二色谱法、傅利叶红外光谱法等联用的方式分析了ACN与BSA相互作用过程中的光谱变化情况，获取BSA荧光强度、发射峰、吸收峰特征等指标。通过理论模型对这些指标参数的分析，计算得到结合常数、结合位点数、结合距离等信息，从而阐明ACN与BSA相互作用的机理及对BSA功能结构的影响，为ACN在医药、食品及化妆品工业的发展提供可靠的科学依据。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

花青素（anthocyanin，ACN）　分析纯，大连美仑生物技术有限公司，实验中浓度为4×10⁻³ mol/L；牛血清白蛋白（BSA）　Sigma公司；华法林　分析纯，山东西亚化学工业有限公司；布洛芬　分析纯，上海萨恩化学技术有限公司；实验用水　均为超纯水。

FLS920荧光光谱仪　英国爱丁堡仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计　北京普析通用仪器有限责任公司；Chirascan圆二色光谱仪　英国应用光物理公司；Nicolet-380傅利叶红外光谱仪　美国热电高力公司。

1.2   实验方法

1.2.1   溶液配制

BSA溶液：将BSA（Mr=66430）溶于PBS缓冲溶液中，配制成浓度为1×10⁻³ mol/L的BSA储备液，保存于4 ℃冰箱备用，使用时根据需要以PBS稀释至所需浓度；ACN溶液：用无水乙醇配制成本体浓度为4×10⁻³ mol/L的ACN储备液^[2-3]。

1.2.2   荧光光谱

荧光实验中设置比色皿内BSA溶液终浓度为1×10⁻⁵ mol/L，ACN溶液本体浓度为4×10⁻³ mol/L。各荧光实验中滴入的ACN含量呈浓度梯度增加^[2]。

1.2.2.1   变温荧光

设置ACN与BSA浓度比为0:1（a）、1:1（b）、2:1（c）、3:1（d）、4:1（e）、5:1（f）、6:1（g）、7:1（h）、8:1（i）。在激发波长280 nm和狭缝3 nm条件下，分别扫描298、304和310 K时，ACN-BSA体系的荧光光谱，波长范围为300～500 nm^[2]。

1.2.2.2   同步荧光

设置ACN与BSA浓度比为0:1（a）、1:1（b）、2:1（c）、3:1（d）、4:1（e）、5:1（f）、6:1（g）、7:1（h）、8:1（i）。固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，在激发波长280 nm、狭缝宽度3 nm和发射波长340 nm、狭缝宽度5 nm的条件下，扫描250～400 nm范围内BSA和ACN溶剂体系的同步荧光光谱^{[2, 6]}。

1.2.2.3   位点竞争

设置ACN与BSA混合后的浓度比例分别为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1。选用两种位点竞争剂布洛芬和华法林，固定激发波长为280 nm，在298 K的条件下分别测定不同探针下的荧光光谱^[12]。

1.2.3   紫外-可见吸收光谱

据文献[3]报道，ACN加入会导致BSA在280 nm处吸光度下降，经过重复实验，本研究中设置紫外光谱实验中BSA浓度为1×10⁻⁵ mol/L(a)，ACN与BSA混合后的浓度比例分别为1:1（b）、2:1（c）、3:1（d）、4:1（e）、5:1（f）、6:1（g）。固定扫描区间为190～400 nm，测定在298 K条件下的紫外-可见吸收光谱。

1.2.4   圆二色谱

BSA终浓度为5×10⁻⁶ mol/L(a)，ACN和BSA混合液浓度比分别为1:1（b）和2:1（c），固定波长在180 ～260 nm之间，在持续通氮气的条件下，分别测定298 K时不同溶剂体系的圆二色谱图^[12]。

1.2.5   红外光谱

BSA终浓度为1×10⁻⁵ mol/L，BSA与ACN混合体系的浓度比为1:6。固定扫描区间为2000～1600 cm⁻¹，利用液膜法分别测定不同溶剂体系的红外光谱^[2]。

1.3   数据处理

本文运用Origin 2018、OMNIC 8.0、CDNN等软件处理实验数据，获得ACN与BSA相互作用的机理及热力学特征。根据热力学公式计算得到ACN与BSA之间的热力学常数。

2.   结果与分析

2.1   荧光光谱分析

2.1.1   变温荧光分析

2.1.1.1   ACN对BSA猝灭方式的判定

荧光猝灭类型分为动态猝灭和静态猝灭，可以依据体系对温度的变化趋势来判断动态和静态猝灭^[12]，动态猝灭常数随着温度的增大而增大，而静态猝灭常数随着温度的增大而减小。假设ACN对BSA的荧光猝灭为静态猝灭，则该猝灭服从Stern-Volmer方程^[13-15]：

式（1）中：F₀、F为未加入和已加入ACN时BSA的荧光强度；[Q]为ACN的摩尔浓度；K_sv为猝灭常数；K_q为猝灭速率常数；τ₀为无ACN存在时荧光分子的平均寿命，一般τ₀约为10⁻⁸ s^[16]。

作出F₀/F-[Q]关系图并计算出不同温度下的静态猝灭常数K_sv，结果如图1和表1。随着ACN的加入，BSA荧光强度减小，BSA的最大发射波长发生微小蓝移，表明ACN对BSA的内源荧光有明显的猝灭作用，说明ACN与BSA发生了结合作用使其构象发生改变。随着温度的升高，猝灭常数K_sv减小，表明ACN与BSA的荧光猝灭类型属于静态猝灭。

图  1  ACN与BSA作用的荧光猝灭图（A，298 K）和Stern-Volmer曲线（B）

Figure  1.  Fluorescence spectra (A，298 K) and Stern-Volmer curve(B) of interaction between ACN and BSA

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表  1  不同温度下ACN与BSA作用的Stern-Volmer猝灭常数

Table  1.  Stern-Volmer quenching constants of interaction between ACN and BSA at different temperatures

T（K）	F0/F=1+Ksv[Q]	Ksv (L/mol）	Kq (L/mol/s)
298	F0/F=0.40[Q]+0.41	4.40×105	4.04×107
304	F0/F=0.35[Q]+0.65	3.48×105	3.48×107
310	F0/F=0.29[Q]+0.77	2.94×105	2.94×107

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2.1.1.2   ACN对BSA结合常数和结合位点数的计算

在蛋白质和小分子相互作用的过程中，结合常数用来表示二者结合的强度，结合位点数表示二者结合时数量之比。可由式（1）得^[17]：

式（2）中：F₀、F分别为未加入和已加入ACN时BSA的荧光强度；[Q]为ACN的浓度；K_a为结合常数；n为结合位点数。

作出lg[(F₀-F)/F]-lg[Q]关系图并计算出不同温度下的结合常数K_a和结合位点数n，结果如图2和表2所示。K_a随温度升高呈下降趋势，表明ACN和BSA结合能力不断降低；n值从1.12增至1.61，总体趋近于1，表明ACN在BSA上主要有一个结合位点。

图  2  不同温度下ACN与BSA作用的结合常数拟合图

Figure  2.  Fitting diagram of binding constants of interaction between ACN and BSA at different temperatures

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表  2  不同温度下ACN与BSA作用的结合常数Ka和结合位点数n

Table  2.  The binding constants K_a and the number of binding sites n for the interaction between ACN and BSA at different temperatures

T（K）	lg[F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q]	Ka (L/mol）	n
298	lg[(F0-F])/F]=1.12[Q]−0.71	0.19	1.12
304	lg[(F0-F)/F]=1.31[Q]−0.80	0.16	1.31
310	lg[(F0-F)/F]=1.61[Q]−1.02	0.10	1.61

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2.1.1.3   ACN对BSA结合作用力的判定

静态猝灭反应的焓变ΔH、熵变ΔS和吉布斯自由能变ΔG可通过不同温度下ACN与BSA作用的静态猝灭常数K_sv求出。假设该反应的焓变ΔH不随温度的改变而改变，故热力学参数可采用以下方程计算^[18]：

式（3）中：R为气体摩尔常数，8.31 J·mol⁻¹·K⁻¹；K_a为结合常数。

结合Ross和Subramanian利用小分子与蛋白质反应的热力学参数的变化判断其作用力类型的规律^[19-20]，由表3可知，ΔH>0，ΔS>0时结合作用力是疏水作用力，即ACN进入BSA的疏水空腔内部是利用疏水作用力完成的，进而形成较稳定的配合物。结合猝灭反应的ΔG<0和ΔH>0，说明该反应自发正向进行。

表  3  ACN与BSA相互作用的热力学参数

Table  3.  Thermodynamic parameters of the interaction between ACN and BSA

温度（K）	ΔG（kJ·mol−1）	ΔH（kJ·mol−1）	ΔS（J·K·mol−1）
298	−31.98	18.74	170.20
304	−32.25	18.74	167.73
310	−32.45	18.74	165.13

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2.1.1.4   ACN与BSA结合距离的计算

根据Forster偶极-偶极非辐射能量转移机理及下列关系式^[11]：

式（5）中：F₀是荧光发射强度，F是荧光发射体与荧光受体浓度比为1:1时的荧光强度，R₀为临界转移能量距离，r为花青素与BSA结合时结合位置处BSA分子中荧光发射基团之间的距离；式（6）中，K、N、$\phi$、J分别表示偶极空间取向因子、介质的折射常数、BSA的荧光量子产率、BSA的荧光发射谱与花青素的吸收光谱的重叠积分；式（7）中：F（λ）是BSA在波长λ处的荧光强度，ε（λ）是花青素在波长λ处的摩尔吸光系数。

在进行非辐射能量转移效率及结合距离的计算时，J值是通过实验浓度条件下猝灭剂ACN紫外谱和荧光体BSA的荧光谱重叠获得（如图3中阴影部分面积）。根据Forster能量转移理论公式可以确定，K²、N⁻⁴、φ分别取1.5、1.36、0.15，ACN与BSA间的能量转移效率E为9.43%，转移效率为50%时的临界距离R₀为1 nm，ACN与BSA的结合距离为1 nm，小于7 nm，说明二者发生了非辐射能量转移^[21]。

图  3  BSA的荧光光谱与ACN的紫外吸收光谱重叠图

Figure  3.  Overlapping absorbance spectra of ACN and fluorescence spectra of BSA

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2.1.2   同步荧光分析

BSA分子中的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸能产生荧光，但BSA的荧光强度主要取决于色氨酸残基。蛋白质的荧光强度与其氨基酸残基所处环境的极性密切相关，在蛋白质的同步荧光光谱中，∆λ=15 nm表示的是酪氨酸残基的光谱性质，∆λ=60 nm表示的是色氨酸残基的光谱性质^[6]。由图4可知，随着ACN浓度的增加，BSA荧光强度均下降，酪氨酸的荧光发射峰的位置红移了2 nm，色氨酸的荧光发射峰的位置蓝移了6 nm，表明ACN受到酪氨酸残基的影响作用很小，主要受到色氨酸残基的影响，则ACN与BSA的结合位点主要是色氨酸残基。

图  4  ACN与BSA相互作用的同步荧光光谱

Figure  4.  Synchronous luorescence spectroscopy of the interaction between CAN and BSA

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2.1.3   位点竞争分析

朱国飞等^[21]通过研究发现，布洛芬和华法林的结合位点主要是site II和site I，本实验分别采用布洛芬和华法林作为位点竞争探针，进一步确定ACN在BSA上的结合位点。

由式（2）计算得知，无位点探针时结合常数为0.13，加入布洛芬后结合常数为0.084，加入华法林后结合常数为0.062。结合图5可知，加入华法林后结合常数降低的幅度比加入布洛芬的大，说明华法林探针对ACN与BSA作用的影响效果更强，表明ACN与BSA结合位点是在site I。

图  5  在不同探针下ACN与BSA相互作用图

Figure  5.  Interaction diagram of ACN and BSA under different probes

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2.2   紫外-可见吸收光谱分析

在小分子与蛋白质相互作用的研究中，紫外-可见吸收光谱是常用的研究方法。BSA与不同浓度的ACN作用后的紫外吸收光谱图如图6所示。

由图6可知，278 nm处的吸收峰是由BSA分子上的色氨酸和酪氨酸残基的芳杂环π-π*跃迁引起的^[22-23]，随着ACN浓度的增加，BSA在278 nm处的吸收峰强度降低，同时伴随着微小红移，表明ACN的加入使BSA的构象发生了变化，进一步证明了ACN和BSA的作用类型以静态猝灭为主。

图  6  BSA与ACN相互作用的紫外-可见吸收光谱

Figure  6.  UV-Vis absorption spectra of interaction between BSA and ACN

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2.3   圆二色谱分析

为进一步研究ACN对BSA构象的影响，运用圆二色谱进行分析，ACN与BSA作用结果如图7所示。

由图7可知，BSA分子在208和222 nm处具有负峰，这是α-螺旋结构的特征吸收峰^[23]，随着加入ACN浓度的升高，这两处的负峰所表示的摩尔椭圆率降低，表明ACN与BSA结合破坏了其分子内氢键^[24]，根据仪器自带的CDNN计算软件可知，随着ACN浓度的增大，α-螺旋含量降低了3.1%，β-折叠含量增加了0.6%，疏水性降低，无规则卷曲含量降低了1.0%，推测ACN的加入使BSA分子的生理结构发生了改变，所以发生了猝灭现象。

图  7  ACN与BSA作用的圆二色谱图

Figure  7.  Circular dichroic diagram of ACN and BSA

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2.4   红外光谱分析

红外光谱可以明确提供蛋白质各二级结构含量的详细数据，因而被广泛应用于蛋白质结构研究。与蛋白质二级结构密切相关的有酰胺Ⅰ带（1600～1700 cm⁻¹）和酰胺Ⅱ带（1500～1600 cm⁻¹）^[25-27]。酰胺Ⅰ带主要由C=O键伸缩振动引起，而酰胺Ⅱ带由C-N的伸缩振动和N-H的弯曲振动造成，其中酰胺Ⅰ带的研究价值更高^[28]。

由于C=O双键的存在，ACN与BSA中都含有酰胺Ⅰ带。由图8可知，加入ACN后，BSA的酰胺Ⅰ带由1636.4 cm⁻¹蓝移到1637.3 cm⁻¹，酰胺Ⅱ带改变不明显。所以随着ACN浓度增加，酰胺Ⅰ带的改变更明显，进一步证明ACN与BSA发生相互作用并对BSA的二级结构产生了影响。

图  8  ACN对BSA红外光谱的影响

Figure  8.  Influence of ACN on BSA by infrared spectrum

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3.   结论

本实验在模拟生理环境的情况下，研究ACN与BSA结合机理及对BSA生理功能的影响。结果表明：ACN对BSA的猝灭类型是静态猝灭，计算得到的热力学参数说明二者间作用力类型是疏水作用力，反应过程自发进行。ACN与BSA结合位点数约为1，位于site I，此位点更接近于色氨酸残基，ACN的加入引起BSA中酪氨酸残基、色氨酸残基所处的环境极性增强，从而改变了BSA的二级结构，使BSA的功能构象发生变化。本研究为ACN在医药、食品及化妆品工业的发展提供了可靠的科学依据和实际参考价值。然而，本研究仅对ACN与BSA的作用机理进行了探讨，ACN的稳定性及吸收效果还需进一步研究。