Study on the Test of Sodium Alginate Lyase Activity
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摘要: 应用酶反应动力学原理对海藻酸钠裂解酶酶活测定反应体系和反应条件进行系统研究，以改进海藻酸钠裂解酶的测定方法。本实验采用紫外吸收法测定酶活，改良后的酶活测定方法为：300 μL底物溶液（海藻酸钠2.2%，KCl 5 mmol/L，0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH7.0）加入50 μL稀释至2.4～30 U/mL的酶液，于37 ℃水浴静置反应20 min后用冰浴终止反应，反应液稀释20倍后在235 nm处测定吸光度。每份底物溶液均需用新枪头移取以提高精密度，使移液误差小于2%。本酶活测定方法的相对标准偏差小于5%。Abstract: Based on the principle of enzyme reaction kinetics, the reaction system and conditions for the test of enzyme activity of sodium alginate lyase were studied in order to improve the test method of sodium alginate lyase. In this experiment, the enzyme activity was measured by ultraviolet absorption method, and the improved method was as follows: 300 μL of substrate solution (sodium alginate 2.2%, KCl 5 mmol/L, 0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 buffer, pH7.0) and 50 μL of enzyme solution diluted to 2.4～30 U/mL was mixed and reacted in a 37 ℃ water bath for 20 minutes, and then the reaction was terminated with an ice bath. After the reaction solution was diluted 20 times, the absorbance was measured at 235 nm. Each substrate solution need to be removed with a new pipette tip to improve the precision, and the pipette error was less than 2%. The relative standard deviation of this enzyme activity determination method was less than 5%.
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海藻酸钠又名褐藻胶，是一种天然的高分子多糖，是海带、马尾藻、巨藻等海藻细胞壁和细胞质的重要组成部分[1-2]。海藻酸钠裂解酶可通过底物的非还原末端的β消去机制降解褐藻胶,将褐藻胶降解为褐藻寡糖[3]。褐藻寡糖是一种功能性低聚寡糖，褐藻胶寡糖由于其降解模式、G/M比、分子量和降解产物的空间构象不同使得褐藻胶寡糖具有多种生物活性[4-8]。褐藻寡糖可作为高效、环保的生物肥料代替传统化学肥料[9]。褐藻胶寡糖在保健食品、医学领域也有很广泛的应用，其具有多种生理活性，如抗肿瘤、刺激细胞因子的产生、减轻炎症、抗菌、抗氧化、调节血脂和糖类等[10-15]。某些特定的褐藻寡糖还可以提高巨噬细胞的活性，诱导单核白细胞生产细胞因子，促进肠道益生菌生长，加速表皮细胞的增长繁殖[16-17]。
目前，海藻酸钠裂解酶的酶活力测定方法主要有硫代巴比妥酸法（TBA）[18]、紫外吸收法[19, 20]、粘度法[21]和还原糖法[22]。上述方法中，硫代巴比妥酸法操作较为繁琐，粘度法要求待测液体积较大，还原糖法需沸水浴加热，而紫外吸收法是基于酶解产生的不饱和糖醛酸在230～240 nm处有吸收峰，这种方法灵敏且便捷，是目前褐藻胶裂解酶酶活力测定的主要方法[23]。常见的紫外吸收法测定海藻酸钠裂解酶酶活力的测量体系各不相同，主要的问题在于海藻酸钠底物浓度太低（质量浓度为0.2%～0.75%[4,24-25]），导致酶促反应并不能接近最大反应速率，且测量范围窄。目前未见有对该酶测定精密度、灵敏度、检测范围等系统研究的报道。
酶活的本质是以最大反应速率来表征酶量，因而理想的酶活测定方法的核心就是使反应速度达到最大的反应体系和反应条件。本文以酶促反应动力学理论为指导，系统研究酶活测定的反应体系和反应条件，为建立准确、高效的海藻酸钠裂解酶酶活测定方法标准提供数据和理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
基因重组的毕赤酵母工程菌 本实验室保存；海藻酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化锌 国药集团化学试剂有限公司，分析纯；氢氧化钠、硫酸镁、硫酸钙、五水合硫酸铜、七水合硫酸亚铁 西陇科学股份有限公司，分析纯。
HH-4型恒温水浴锅 国华电器有限公司；EU2600型紫外分光光度计 上海昂拉仪器有限公司；XZ21K型高速冷冻离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；ZWY−2101C型恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 海藻酸钠裂解酶酶液的制备
将基因重组的毕赤酵母在摇瓶中活化，30 ℃培养24 h；以10%体积比转接至发酵罐中，参考金虎等[26]的培养条件，诱导重组蛋白表达。发酵120 h后，4 ℃、1000 × g离心5 min，收集上清液即为海藻酸钠裂解酶粗酶液。
1.2.2 海藻酸钠裂解酶酶活测定方法
参考文献方法[25,27]并加以调整。底物海藻酸钠用0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH7.0）配制。300 μL底物加入50 μL稀释20倍的酶液于一定温度水浴保温20 min后终止反应，样品稀释20倍后在235 nm下测定其吸光值。
酶活力单位的定义为：在上述反应体系和反应条件下，每分钟水解使吸光度值增加1所用的酶量定义为一个酶活力单位U。
酶浓度(U/mL)=¯OD600实验组−¯OD600对照组20min×0.05mL×稀释倍数 1.2.3 动力学因素的确定
1.2.3.1 底物浓度的确定
37 ℃、pH 7条件下测量0.7～22 g/L底物终浓度时酶的最大反应速率。并采用 Lineweaver−Burk法[28-29]以 1/V 对 1/［S0］作图，计算动力学参数 Km、Vm，确定最适海藻酸钠底物配制浓度。
1.2.3.2 加酶量的确定
在300 μL、22 g/L的底物中加入50 μL 0～5 U的酶液。测定37 ℃、pH 7条件下的加酶量与OD值变化的关系，确定反应体系中合适的加酶量范围。
1.2.3.3 酶促反应时长的确定
以22 g/L海藻酸钠为底物，加酶量9 U/mL，pH 7，温度37 ℃ 条件下，不同反应时间（5～45 min）取样测量酶最大反应速率，确定最适的酶促反应时长。
1.2.3.4 酶促反应的终止方法
在酶促反应20 min后，将反应液放置0 ℃冰浴中60 min，以放置室温（25 ℃）0、10、60 mim作为对照，在最适反应条件下测定酶的反应速率。
1.2.4 环境条件的优化
1.2.4.1 海藻酸钠裂解酶最适反应pH
以22 g/L海藻酸钠为底物，加酶量9 U/mL，温度37 ℃条件下测量酶在不同pH（5～10）缓冲体系下的反应速率，确定酶最适反应pH。
1.2.4.2 海藻酸钠裂解酶最适反应温度
以22 g/L海藻酸钠为底物，加酶量9 U/mL，pH7条件下测量酶在不同温度（20～50 ℃）下的反应速率，确定酶最适反应温度。
1.2.4.3 金属离子对海藻酸钠裂解酶反应速率的影响
在22 g/L海藻酸钠为底物的酶促反应体系中分别添加终浓度为1和5 mmol/L的Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+ 7种金属离子，以未添加金属离子的酶促反应组作为对照组，测量pH 7、37 ℃条件下的酶相对反应速率。
1.2.4.4 传质对酶活测定的影响
采用同一批酶液进行酶活测量，分别测量在最适条件下静置反应和200 r/min摇床反应的酶浓度。
1.2.5 方法的准确性和精密性
1.2.5.1 底物移取的精密性试验
本实验提出两种方法解决底物移取精密性较差的问题，方法1采用100 ℃水浴加热海藻酸钠底物5 min以降低粘度；方法2每个样都使用新枪头；对照组不加热底物也不换枪头。两种方法及对照组分别称重移液300 μL的22 g/L海藻酸钠底物5次，计算两种方法及对照组底物移取重量的平均值、标准偏差和相对标准偏差。
1.2.5.2 方法的精密性试验
重复8次测试同一批酶液的酶浓度，计算平均值、标准偏差、相对标准偏差。
1.3 数据分析
每个实验3次重复，数据以平均值 ± 标准差表示。采用 Graphpad Prism 8.0软件进行数据差异显著性分析和作图。
2. 结果与分析
2.1 动力学因素
2.1.1 底物浓度的确定
根据米氏方程，底物浓度S足够大时，反应速度V0≈Vm=k2e0，不受底物浓度影响，而与酶浓度成正比，可用于表征酶量。在酶活测定反应体系中，底物浓度通常定为5～10 Km，因而需先测出酶的Km值。如图1所示，采用 Lineweaver−Burk法测得Km值为3.17 g/L。
从动力学角度考虑，底物浓度越大，越有利于消除底物浓度对酶活测定的影响，但在实际操作中还要考虑底物的溶解度和黏度。海藻酸钠是高分子量聚合物，溶解度小，黏度大，过高的浓度不容易配制，而且也不容易移取。综合考量，底物浓度设为6 Km左右，通过计算，海藻酸钠溶液浓度定为2.2%（W/V）。
2.1.2 加酶量的确定
米氏方程的前提假设之一是酶浓度远小于底物浓度，同时过大的酶浓度会使底物浓度迅速下降，从而使反应速度降低。对于海藻酸钠裂解酶而言，反应速度不仅受底物浓度影响，而且还受到海藻酸钠分子量影响，分子量越小，反应速度越慢[30]。因此在酶活测定体系中，加入的酶量不宜太大，以保证反应速度与酶量成正比。
由图2可见，在加酶量小于1.5 U时，产物随加酶量线性增加，加酶量超过1.5 U后，曲线斜率开始逐渐下降。因此酶活测定体系加酶量应小于1.5 U。
另一方面，加酶量也不能太小，否则由于分光光度计灵敏度的限制，在测定时间内无法测到OD235。为保证测量的有效数位，OD235读数应在0.1以上，由此倒算，最小加酶量为0.12 U。因此反应体系发酵酶液上样的浓度应稀释至2.4～30 U/mL。
2.1.3 酶促反应时长的确定
不同反应时间下取样测量酶的最大反应速率，结果如图3所示。
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图 3 酶促反应速率与反应时间的关系Figure 3. Relationship between enzymatic reaction rate and reaction time随着反应的进行，底物浓度不断降低，酶不断失活，因而反应速率越来越低，因此酶活测定的反应时间不能太长。另一方面，反应时间过短，则会导致检测的灵敏度下降，同时还会导致测定误差变大。为确定反应时间，本实验测定了不同反应时间下的平均反应速度，结果如图3所示，反应时间在20 min以内，平均反应速度几乎不变，反应时间超过20 min后，反应速率开始明显下降，表明反应时间不能超过20 min。同时也注意到，在反应时间2 min时测得的反应速度的误差很大。因此，以2.2%海藻酸钠底物测量海藻酸钠裂解酶活性时，反应时间设为20 min较为合适。
2.1.4 酶促反应的终止方法
酶活的测定需要及时终止反应，现有的终止反应方法有高温、加酸、加碱、冰浴等。其中，高温终止反应方法操作繁琐，加热过程容易使EP管开盖，造成样品损失或污染。加酸、加碱的方法改变了反应液的体积，加液的误差会影响最终测定的结果，而且当有较多样品需要同时进行酶活测定时，难以保证同时终止。此外海藻酸钠在高温、酸、碱环境中也会水解，会造成测定结果偏大。冰浴的方法没有上述缺点，但冰浴不能使酶失活，而只能使反应速率降低。如果冰浴能把反应速率降到足够低，在较短时间内检测不到产物变化，也可将冰浴做为终止反应的有效方法。
如图4所示，37 ℃反应结束后，反应液在25 ℃下放置10 min就对测定结果有显著影响（P<0.05），而在冰浴中放置1 h，对酶活测定没有影响。相比高温、加酸、加碱的终止反应方法，冰浴终止酶解反应的方法有安全、易操作、效果好等优点。
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图 4 冰浴终止酶解反应的效果注：“***”表示极显著（P<0.001）；“*”表示显著（P<0.05）；“ns”表示没有显著性差异。Figure 4. The effect of ice bath to terminate the enzymatic hydrolysis reaction2.2 环境条件的影响
2.2.1 海藻酸钠裂解酶最适反应pH
磷酸钠缓冲液pH对海藻酸钠裂解酶反应速率的影响如图5所示。
结果表明，pH6.5～7.5时，海藻酸钠裂解酶的酶促反应速率最大，有较宽的最适反应pH范围。pH小于6或大于8时，酶反应速率明显下降。这表明此时的水解pH已经影响了海藻酸钠裂解酶的活性，偏离海藻酸钠裂解酶最适pH范围的过酸或过碱的水解环境会导致其酶活逐渐丧失。酶活测定一般选择在最适pH下测定，根据图5结果，选择测定pH7.0。
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图 5 海藻酸钠裂解酶在不同pH条件下的反应速率Figure 5. Reaction rate of sodium alginate lyase under different pH conditions2.2.2 海藻酸钠裂解酶最适反应温度
温度对海藻酸钠裂解酶反应速率的影响如图6所示。
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图 6 海藻酸钠裂解酶在不同温度条件下的反应速率Figure 6. Reaction rate of sodium alginate lyase under different temperature conditions温度对于酶反应而言是把双刃剑，提高温度一方面可以增加分子碰撞几率，从而提高反应速度，另一方面会加快酶失活，从而降低反应速度。图6结果表明，在我们的测定条件下，最适反应温度范围为37～46 ℃，我们选定常用的37 ℃为测定温度。
2.2.3 金属离子对海藻酸钠裂解酶反应速率的影响
金属离子会显著影响海藻酸钠裂解酶活性[27]。添加适量的激活剂可提高酶活测定的灵敏度。为此考察了7种金属离子对酶活性的影响。结果如图7所示。
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图 7 金属离子对海藻酸钠裂解酶酶反应速率的影响注：“**”表示较显著（P<0.01）；“*”表示显著（P<0.05）。Figure 7. Effect of metal ions on the reaction rate of sodium alginate lyase终浓度为1 mmol/L时，Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+对该酶具有一定程度的促进作用；Fe2+、Cu2+对该酶具有不同程度的抑制作用，Fe2+抑制效果较为明显。终浓度为5 mmol/L时，Na+、K+、Mg2+对该酶具有不同程度的促进作用，K+效果最好，相对反应速率达到114%；Ca2+、Fe2+、Cu2+对该酶具有不同程度的抑制作用，Cu2+抑制效果较为明显。据韩伟等[31]报道， Cu2+对海藻酸钠裂解酶有抑制作用，1 mmol/L Ca2+有一定促进作用，而5 mmol/L Ca2+反而对酶产生抑制作用，与本实验结果一致。在酶活测定时，可在反应体系中添加5 mmol/L的K+以提高酶的最大反应速率。
2.2.4 传质对酶活测定的影响
通常酶活测定体系较小，不受传质影响，可在静置条件下测定。然而本实验所使用的海藻酸钠浓度较高，黏度大，传质可能会成为反应的限制性因素。为此分别考察了静置和200 r/min振荡条件对酶活测定的影响，结果如图8所示。
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图 8 传质速度对酶活测定的影响注：“ns”表示没有显著性差异。Figure 8. Effect of mass transfer speed on enzyme activity determination结果表明，在2.2%海藻酸钠底物反应条件下，静置反应与200 r/min振荡反应下的酶活力测量数值无显著差异。这是由于反应体系体积很小，传质影响小，因此静置反应即可。
2.3 方法准确性与精密性
2.3.1 底物移取的精密性试验
海藻酸钠是一种常见的增稠剂，改进后的酶活测定方法将0.5%海藻酸钠的底物改为2.2%，海藻酸钠底物的黏度明显提高，这会导致移液枪进样量精密度变差。为了解决这个问题，本实验提出两个方案，一是将底物加热到100 ℃以降低黏度，二是每个样都使用新枪头，测试结果如图9所示。
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图 9 不同条件对底物移取的精密性影响Figure 9. The influence of different conditions on the precision of substrate removal结果表明，沸水浴加热降低底物粘度的方法有一定效果，底物移取的相对标准偏差由10.4%降为8.2%。而每加一个样换一个枪头的方法，底物移液误差最小，效果最好，相对标准偏差小于2%。另外要注意的是，每个枪头需要剪去前端一小节，增大横截面积，以免底物堵塞枪头。
2.3.2 精密性试验
取同一批发酵液，采用改进后的方法重复测量海藻酸钠裂解酶的酶活性8次，精密性试验结果如表1所示。
表 1 海藻酸钠裂解酶酶活测定的精密度试验（n=8）Table 1. Precision test for determination of enzyme activity of sodium alginate lyase (n=8)酶活测定值（U/mL） 平均值（U/mL) SD标准偏差（U/mL) RSD相对标准偏差（%） 161～181 170 7.72 4.54 由表1可知，用改进后的方法测量的8组平行海藻酸钠裂解酶酶活力数值波动范围较小，标准偏差为7.72 U/mL，相对标准偏差为4.54%，检测结果精密度高，可见此方法可信，检测结果有效。
3. 结论
通过对影响酶活测定因素的系统研究，本文建立了海藻酸钠裂解酶活力测定方法：300 μL底物溶液（海藻酸钠2.2%，KCl 5 mmol/L，0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH7.0）加入50 μL稀释至2.4～30 U/mL的酶液，于37 ℃水浴静置反应20 min后用冰浴终止反应，反应液稀释20倍后在235 nm处测定吸光度。每份底物溶液均需用新枪头移取以提高精密度。本方法相对标准偏差小于5%。该研究主要解决了传统紫外吸收法测量酶活的海藻酸钠底物浓度太低问题，并研究了提高底物浓度后带来的一系列问题，为制订海藻酸钠裂解酶活性测定方法标准提供数据支撑。
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图 3 酶促反应速率与反应时间的关系
Figure 3. Relationship between enzymatic reaction rate and reaction time
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图 4 冰浴终止酶解反应的效果
注：“***”表示极显著（P<0.001）；“*”表示显著（P<0.05）；“ns”表示没有显著性差异。
Figure 4. The effect of ice bath to terminate the enzymatic hydrolysis reaction
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图 5 海藻酸钠裂解酶在不同pH条件下的反应速率
Figure 5. Reaction rate of sodium alginate lyase under different pH conditions
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图 6 海藻酸钠裂解酶在不同温度条件下的反应速率
Figure 6. Reaction rate of sodium alginate lyase under different temperature conditions
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图 7 金属离子对海藻酸钠裂解酶酶反应速率的影响
注：“**”表示较显著（P<0.01）；“*”表示显著（P<0.05）。
Figure 7. Effect of metal ions on the reaction rate of sodium alginate lyase
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图 8 传质速度对酶活测定的影响
注：“ns”表示没有显著性差异。
Figure 8. Effect of mass transfer speed on enzyme activity determination
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图 9 不同条件对底物移取的精密性影响
Figure 9. The influence of different conditions on the precision of substrate removal
表 1 海藻酸钠裂解酶酶活测定的精密度试验（n=8）
Table 1 Precision test for determination of enzyme activity of sodium alginate lyase (n=8)
酶活测定值（U/mL） 平均值（U/mL) SD标准偏差（U/mL) RSD相对标准偏差（%） 161～181 170 7.72 4.54 
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