超高效液相色谱-串联质谱法同时测定玉米中9种真菌毒素

谭莉; 孟繁磊; 范宏; ANNANowacka; 魏春雁

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2020050057

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定玉米中9种真菌毒素

1.
吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（长春），吉林长春 130033
2.
波兰国立植物保护研究所，波兹南 60-318

基金项目: 吉林省科技发展计划项目（20180414076GH）；国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP2019004）

详细信息

作者简介:
谭莉（1991−），女，硕士，主要从事农产品质量安全检测技术方面的研究，E-mail：litan1235@163.com

通讯作者:
魏春雁（1962−），女，博士，研究员，主要从事农产品质量安全方面的研究，E-mail：weichy@yeah.net

中图分类号: TS213.4
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出版历程
- 收稿日期: 2020-05-07
- 网络出版日期: 2021-01-27
- 刊出日期: 2021-03-31

Determination of 9 Kinds of Mycotoxins in Maize by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

1.
Institute of Agricultural Quality Standard and Testing Technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences/Risk Assessment Lab of Agri-products Quality and Safety (Changchun), Agriculture Ministry of P.R.C, Changchun 130033, China
2.
Institute of Plant Protection, National Research Institute, Poznan 60-318, Poland

摘要

摘要: 为高效检测玉米中的生物毒素，采用80%乙腈−0.1%甲酸水溶液提取、QuEChERS法净化、甲醇−0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵水溶液经C₁₈柱梯度洗脱分离、电喷雾正负离子同时扫描并多反应监测模式采集数据的综合方法，对玉米中黄曲霉毒素B₁、B₂、伏马毒素B₁、B₂、B₃、呕吐毒素、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇及玉米赤霉烯酮9种真菌毒素进行同时测定。结果表明，9种真菌毒素在0.25～250 μg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数均在0.9999以上，检出限在0.079～1.8 μg/kg之间，定量限在0.26～6.0 μg/kg之间，回收率在80.2%～113.8%之间，相对标准偏差≤7.7%。用该方法同时检测吉林省240份玉米样品中9种真菌毒素，其中未检测出黄曲霉毒素B₁、B₂，但其它7种毒素均有检出，其中ZEN检出率最小，为14.6%，FB₂检出率最大，达到98.3%。本方法操作简单、灵敏度高、重现性好，结果准确，适用于玉米中多组分真菌毒素同时检测。
- 超高效液相色谱-串联质谱法 /
- 玉米 /
- 真菌毒素
Abstract: In order to effectively detect the biological toxins in maize, 80% acetonitrile -0.1% formic acid aqueous solution extraction, QuEChERS purification, methanol −0.1% formic acid +5 mmol/L ammonium formate aqueous solution using C₁₈ column and gradient elution separation, electrospray positive and negative ions simultaneous scanning, and multiple reaction monitoring mode synthesis method of gathering data were applied to simultaneously determine nine mycotoxins including aflatoxin B₁, aflatoxin B₂, fumonisin B₁, fumonisin B₂, fumonisin B₃, vomitoxin, 3-acetyl-deoxynivalenol, 15-acetyl-deoxynivalenol and zearalenone. Results showed that, the linear relationship of 9 kinds of mycotoxins were good in the concentration range of 0.25～250 μg/L, the correlation coefficient was above 0.9999, the detection limit was 0.079～1.8 μg/kg, the quantitative limit was 0.26～6.0 μg/kg, the recovery rate was 80.2%～113.8%, the relative standard deviation ≤ 7.7%. Nine mycotoxins were detected in 240 maize samples in Jilin province by this method, in which the aflatoxin B₁, B₂ were not detected, but the other seven toxins were detected. The detection rate of zearalenone was the lowest (14.6%) and FB₂ was the highest (98.3%). This method is simple, sensitive, reproducible and accurate. It is suitable for the simultaneous determination of mycotoxins in maize.
- UPLC-MS/MS /
- maize /
- mycotoxins

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真菌毒素（Mycotoxin）又称霉菌毒素，是真菌在适宜的环境条件下产生的有毒次级代谢产物^[1]，粮食在生长期、收获期和储存期都可能被真菌毒素污染，直接或间接进入人类食物链中，威胁人类健康^[2-3]。黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是迄今发现的毒性最强的一类真菌毒素，主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，AFTB₁、AFTB₂、AFTG₁和AFTG₂四种是其重要的代表性成分，其中，AFTB₁的毒性最强^[4]。伏马毒素（Fumonisins, FB）主要是由串珠镰刀菌属真菌产生的一类强毒和致癌性的真菌毒素，FB₁、FB₂、FB₃是其代表性成分，其中，毒性最强的FB₁是其主要成分^[5]。呕吐毒素（又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇Deoxynivalenol, DON）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）主要由镰刀菌属真菌产生，是目前为止对粮食污染最普遍的毒素^[6-7]。真菌毒素污染是全球性问题，有研究对来自全球72个国家的18757个农产品样品进行筛查，发现部分样品受到不同程度的真菌污染，其中，我国样品中FB、AFTB、ZEN和DON等检出率均超过25%，并且存在混合污染现象^[8-9]。严格控制这些真菌对玉米等粮油作物及其他农产品的污染，是保障人类健康的必然要求^[10]。

开发玉米等农产品中真菌毒素高效检测技术，是掌握玉米等农产品中真菌毒素污染水平的重要手段，是为玉米等农产品生产中疫情监测和适宜防疫措施的建立提供的一种有力技术支持，对玉米等产业持续健康发展具有重要作用。目前，真菌毒素的检测方法主要有液相色谱法^[11-12]、荧光光度法^[13-14]、酶联免疫吸附法^[15-16]、薄层色谱法^[17-18]和液相色谱-串联质谱法^[19-20]等。样品中真菌毒素净化方法一般用免疫亲和柱等净化柱进行固相萃取，不仅存在过程繁琐，成本较高等问题，并且在检测过程中同时测定毒素种类较少；而本文综合利用UPLC-MS/MS和QuEChERS法的优势，在相关研究的基础上，建立了快速准确的测定玉米中9种真菌毒素的方法。

本文借助超高效液相色谱-串联质谱仪，通过对提取方法的改进，以及对色谱、质谱条件优化降低基质干扰，旨在建立玉米中AFTB₁、AFTB₂、FB₁、FB₂、FB₃、DON、15-ADON、3-ADON和ZEN 9种真菌毒素同时检测的一种高效方法，为玉米等农产品中真菌毒素的检测、污染监测及风险评估提供技术支撑。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

待测玉米样品　2019年秋收时节采集自吉林省，共240份；空白玉米样品　本实验室2018年检测并留存的无生物毒素污染的玉米样品1份；标准物质AFTB₁（2.02 μg/mL）、AFTB₂（0.502 μg/mL）、ZEN（100.2 μg/mL）、FB₁（50.1 μg/mL）、FB₂（50.0 μg/mL）、FB₃（50.3 μg/mL）、DON（100.0 μg/mL）、15-ADON（100.1 μg/mL）和3-ADON（100.3 μg/mL）　ROMER公司；乙腈、甲醇、甲酸　色谱级，美国Thermo Fisher公司；萃取包填料为4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠二水合物和0.5 g柠檬酸二钠　美国Agilent公司。

QTRAP 5500质谱仪　美国AB Sciex公司；LC-30A超高效液相色谱仪　日本Shimadzu公司；GENIUS 3涡旋混匀器　德国IKA公司；MULTIFUGE X3R离心机　美国Thermo Fisher公司；HZQ-C空气浴振荡器　东联电子技术开发有限公司；FW-100高速万能粉碎机　北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

取玉米试样，高速粉碎机粉碎过18目筛子，混匀，称取2.00 g于50 mL离心管内，加入20 mL 80%乙腈−0.1%甲酸水溶液，恒温振荡器内振荡提取30 min，加入萃取包，振摇2 min净化，10000 r/min离心5 min，取上清液2.0 mL于试管内，50 ℃水浴氮吹至近干，用1.0 mL甲醇-水溶液（v/v=1:1）溶解，涡旋1 min，过0.22 μm滤膜于样品瓶内，待上机。

1.2.2 标准溶液的配制

1.2.2.1 单标溶液的配制

移取FB₁、FB₂、FB₃标准物质各10 μL，DON、15-ADON、3-ADON和ZEN标准物质各5 μL分别用甲醇定容到10 mL容量瓶内，移取AFTB₁标准物质120 μL用甲醇定容到5 mL容量瓶内，移取AFTB₂标准物质200 μL用甲醇定容到2 mL容量瓶内，即：将9种真菌毒素分别配制成50 μg/L的单标溶液。

1.2.2.2 混合标准中间液的配制

取10 mL容量瓶1只，分别准确移入FB₁、FB₂和FB₃标准品溶液各100 μL，配制浓度为0.50100、0.50000、0.50300 μg/mL；移入DON、15-ADON、3-ADON和ZEN标准品溶液各50 μL，配制浓度为0.50020、0.50020、0.50060 μg/mL；移入AFTB₁标准品溶液200 μL，配制浓度为0.04004 μg/mL；AFTB₂标准品溶液400 μL，配制浓度为0.02008 μg/mL；用甲醇定容至刻度，−20 ℃保存备用。

1.2.2.3 混合标准工作液的配制

取空白玉米样品，按照1.2.1项处理，得到空白玉米基质提取液，根据9种毒素在质谱中的响应值，用空白基质配制FB₁、FB₂、FB₃、DON、15-ADON、3-ADON和ZEN质量浓度为6.25、31.25、62.5、125、250 μg/L，AFTB₁质量浓度为0.5、2.5、5、10、20 μg/L，AFTB₂质量浓度为0.25、1.25、2.5、5、10 μg/L的混合标准工作溶液，现用现配。

1.2.2.4 标准曲线绘制

采用空白玉米样品提取溶液分别配制成系列基质对照品溶液。其中FB₁、FB₂、FB₃、DON、15-ADON、3-ADON和ZEN浓度为6.25～250 μg/L，AFTB₁浓度为0.5～20 μg/L，AFTB₂浓度为0.25～10 μg/L，以毒素浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，拟合标准曲线。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱：C₁₈（2.1 mm × 100 mm，1.7 µm；）；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：3 µL；流动相：A−0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸铵水溶液，B-甲醇；梯度洗脱模式见表1。

表 1 梯度洗脱程序

Table 1. Gradient elution procedures

时间（min）	流速（mL/min）	甲醇（%）	时间（min）	流速（mL/min）	甲醇（%）
0	0.3	10.0	10.5	0.3	60.0
2.0	0.3	10.0	13.5	0.3	60.0
3.0	0.3	20.0	14.5	0.3	95.0
4.0	0.3	21.0	17.0	0.3	95.0
5.0	0.3	26.0	18.0	0.3	10.0
7.0	0.3	26.0	20.0	0.3	10.0

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1.2.3.2 质谱条件

离子源为ESI源；扫描方式：Scheduled MRM^TM采集模式，正负离子同时扫描；离子化电压：正模式5500 V，负模式−4500 V；气帘气30 Psi；雾化温度：550 ℃；雾化气：55 Psi；辅助气：55 Psi。

1.3 数据处理

采用Analyst Softwaer软件进行采集数据；用MultiQuant 3.0.2软件进行处理，本文所用数据平行及重复次数、数据表示形式、统计学分析方法、显著性水平均采用Excel办公软件；绘图软件采用Orign8.0软件处理。

2. 结果与分析

2.1 仪器条件优化

2.1.1 质谱条件优化

将9种真菌毒素单标溶液，分别通过针泵直接注射进入质谱中，测定其正负模式下质谱信号强度，确定各个毒素的母离子质量数。通过优化可知，AFTB₁、AFTB₂、FB₁、FB₂、FB₃、DON、3-ADON和15-ADON在正模式下[M+H]⁺灵敏度最高，而ZEN在正模式下[M-H]⁻离子响应值大。确定母离子后，对母离子进行全扫描分析二级质谱图，确定其子离子，最后对碰撞能量（CE）和去簇电压（DP）优化，确定9种真菌毒素质谱条件如表2。

表 2 质谱条件

Table 2. Mass spectrum conditions

毒素	扫描模式	保留时间（min）	监测离子对	碰撞能量CE（V）	去簇电压DP（V）
AFTB₁	正	4.0	313/285^*；313/241	31；49	150
AFTB₂	正	3.7	315/287^*；315/259	35；39	150
ZEN	负	6.9	317/175^*；317/131	−32；−38	−140
DON	正	1.9	297/203^*；297/249	22；16	110
3-ADON	正	2.7	339/203^*；339/231	20；16	120
15-ADON	正	2.7	339/137^*；339/231	11；16	120
FB₁	正	5.6	723/334^*；723/352	55；50	150
FB₂	正	6.9	706/336^*；706/318	50；55	150
FB₃	正	7.6	706/336^*；706/318	50；48	150
注：*表示定量离子。

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在一次进样过程中，为了监测更多的离子对，采用Scheduled MRM^TM采集模式，预设保留时间，在短时间窗口内采集单个离子对，使每个分析物的占空比大大增加，结合快速级性转换，实现了一次进样，正负模式同时采集，缩短了样品的分析时间。

2.1.2 色谱条件优化

选择C₁₈色谱柱为分离柱；通过对比等度洗脱和梯度洗脱模式，最终优化出在梯度洗脱模式下，使色谱峰分离效果好；并分别使用甲醇和乙腈分离这9种真菌毒素，结果显示，在甲醇溶液中加入0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸铵，有利于被分析组分离子化；3-ADON和15-ADON在色谱中保留时间相同，但质谱条件不同，不影响定性定量分析，而FB₂和FB₃在质谱中的母离子和子离子相同，在色谱中却得到很好分离，因而也不影响定性定量分析（图1）。

图 1 9种真菌毒素离子流图

注：A为8种真菌毒素混合标准溶液总离子流图，B为ZEN标准溶液离子流图。

Figure 1. Ion flow diagram of 9 fungal toxins

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2.2 方法学考察

2.2.1 方法的线性范围、检出限及定量限

以毒素质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，拟合标准曲线，列于表3。9种真菌毒素在相对应的线性范围内，线性关系良好，相关系数均大于0.9999。

表 3 方法的线性范围、检出限及定量限

Table 3. Linear range, detection limit and quantitative limit of the method

毒素	标准曲线	线性范围(μg/L)	相关系数(r）	LOD(μg/kg)	LOQ(μg/kg)
ZEN	Y=3003.6 X+4.1×10⁴	6.25～250	0.99998	0.73	2.4
AFTB₂	Y=11183.3 X−2731.5	0.25～10	0.99995	0.079	0.26
AFTB₁	Y=15592.1 X−5794.9	0.50～20	0.99997	0.14	0.48
FB₁	Y=371.1 X−6009.7	6.25～250	0.99991	1.3	4.3
FB₂	Y=551.1 X−6475.4	6.25～250	0.99995	0.26	0.86
FB₃	Y=477.3 X−6153.3	6.25～250	0.99993	1.8	6.0
DON	Y=120.9 X−519.0	6.25～250	0.99993	1.4	4.6
3-ADON	Y=339.3 X−1819.6	6.25～250	0.99998	1.1	3.8
15-ADON	Y=355.4 X−1652.3	6.25～250	0.99999	1.1	3.8

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当信噪比S/N=3时确定检出限（LOD），信噪比S/N=10时确定定量限（LOQ），ZEN检出限为0.73 μg/kg，定量限为2.4 μg/kg；AFTB₂和AFTB₁的检出限分别为0.079、0.14 μg/kg，定量限为0.26和0.48 μg/kg；FB₁、FB₂、FB₃的检出限依次为1.3、0.26、1.8 μg/kg，定量限为4.3、0.86、6.0 μg/kg；DON、3-ADON和15-ADON的检出限为1.4、1.1、1.1 μg/kg，定量限为4.6、3.8、3.8 μg/kg，结果见表3。

2.2.2 方法的准确度及精密度

取空白玉米基质，加入不同浓度的混合标准工作溶液，平行测定6次，计算平均回收率和相对标准偏差，结果见表4。9种真菌毒素平均回收率在80.2%～113.8%之间，RSD在0.2%～7.7%之间，表明该方法准确度和精密度均较好，达到欧盟法规要求^[21]。

表 4 9种真菌毒素平均回收率和精密度（n = 6）

Table 4. Average recovery and precision of 9 mycotoxins (n = 6)

毒素	添加量（μg/kg）	平均值（μg/kg）	回收率（%）	RSD（%）
ZEN	250	255.8	102.3	7.7
AFTB₂	10	8.3	83.4	0.2
AFTB₁	20	19.2	95.6	0.5
FB₁	250	227.6	80.2	2.2
FB₂	250	253.9	101.5	0.8
FB₃	250	244.9	97.9	2.9
DON	250	268.4	107.4	7.3
3-ADON	250	284.4	113.8	5.4
15-ADON	250	272.3	108.9	7.6

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2.2.3 基质效应

分别测定空白玉米基质提取液配制的混合标准工作液和50%甲醇水溶液配制的混合标准工作液，计算峰面积比可得到9种真菌毒素的基质效应值。计算公式如下：

M E = \frac{A m}{A s} \times 100

${\rm{ME}} = \frac{{{\rm{A}}{\rm{m}}}}{{{\rm{As}}}} \times 100$

式中：ME：基质效应（%）；Am：空白基质配制的混合标准溶液色谱峰面积；As：50%甲醇水溶液配制的混合标准溶液色谱峰面积。

当ME=100%时，没有基质效应；当ME<100%时，为基质抑制效应；ME>100%时，为基质增强效应。实际检测过程中，很难存在ME=100%的理想状态，ME在85%～115%之间时，即认定为基质效应不明显。

图2给出的是9种真菌毒素基质效应结果。由图2可知，9种真菌毒素均具有基质效应，其中FB₁、FB₂、FB₃和15-ADON基质效应分别为110.05%、106.96%、107.67%和89.29%均在85%～115%之间，表明基质效应不明显；DON基质效应为125.57%，只有DON为基质增强效应，而ZEN、AFTB₁、AFTB₂、3-ADON基质效应分别为63.87%、71.34%、56.68%和83.85%，基质效应均小于85%，表现基质抑制效应，AFTB₂的抑制效应最强。在实际检测过程中，应选用空白玉米基质提取液配制标准溶液，外标法定量来降低基质抑制效应的影响。

图 2 9种真菌毒素基质效应散点图

Figure 2. Scatter plots of matrix effects of 9 mycotoxins

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2.2.4 与国标仪器方法对比

取空白玉米基质溶液，按25 μg/kg加标，制成阳性样品，分别按照GB 5009.240-2016《食品中伏马毒素的测定》^[22]、GB 5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》^[23]、GB 5009.209-2016《食品中玉米赤霉烯酮的测定》^[24]、GB 5009.111-2016《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》^[25]中的液相色谱-串联质谱法和本法进行测定，平行测定6次。结果见表5。比较发现，本方法与国标方法检测结果没有显著性差异（P>0.05），表明本方法既准确可靠，切实可行，又操作更简单、用时更短、效率更高（同时检测9种成分）。

表 5 本方法与国标方法对比结果（n = 6）

Table 5. Comparison results between this method and GB method (n = 6)

毒素	测定结果（μg·kg⁻¹）		P
毒素	本方法	国标方法	P
AFTB₁	24.36 ± 0.92	25.53 ± 0.95	>0.05差异不显著
AFTB₂	25.47 ± 1.22	25.89 ± 1.08
ZEN	25.09 ± 1.57	24.59 ± 1.48
DON	25.11 ± 1.75	25.02 ± 1.68
3-ADON	24.70 ± 1.31	25.12 ± 1.14
15-ADON	24.83 ± 1.91	24.72 ± 1.32
FB₁	24.80 ± 0.26	25.42 ± 0.38
FB₂	25.47 ± 0.59	24.74 ± 0.46
FB₃	25.45 ± 0.98	25.51 ± 0.73

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2.2.5 样品检测

应用本法对吉林省产240份玉米样品进行检测，结果发现，240份样品中，AFTB₁和AFTB₂未有检出，但不同程度检出ZEN、DON、3-ADON、15-ADON、FB₁、FB₂和FB₃，其中ZEN检出率为14.6%，含量为9.9～13530.5 μg/kg；DON检出率为52.9%，含量为9.5～1806.3 μg/kg；3-ADON检出率为30.4%，含量为10.1～205.6 μg/kg；15-ADON检出率为45.1%，含量为11.0～1472.2 μg/kg；伏马毒素检出率最高，FB₁检出率达到96.7%，含量为14.5～23270.1 μg/kg；FB₂检出率为98.3%，含量为29.8～5877.1 μg/kg；FB₃检出率为85.8%，含量为17.3～3365.5 μg/kg；具体结果见表6。而且一个样品中同时检出几种毒素现象较多，表7给出样品中同时检测出5种毒素情况，表明吉林省玉米存在真菌毒素混合污染问题。

表 6 240份玉米样品中各毒素含量的最大值、最小值及检出率

Table 6. Maximum and minimum values and detection rates of each toxin content in 240 maize samples

毒素	最低检出值（μg/kg）	最高检出值（μg/kg）	检出率（%）
ZEN	9.9	13530.5	14.6
DON	9.5	1806.3	52.9
3-ADON	10.1	205.6	30.4
15-ADON	11.0	1472.2	45.1
FB₁	14.5	23270.1	96.7
FB₂	29.8	5877.1	98.3
FB₃	17.3	3365.5	85.8
AFB1	/	/	/
AFB2	/	/	/
注：/表示未检出。

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表 7 同时检测出5种毒素的玉米样品

Table 7. Maize samples with 5 toxins detected simultaneously

样品编号	ZEN （μg/kg）	AFB₂ （μg/kg）	AFB₁ （μg/kg）	FB₁ （μg/kg）	FB₂ （μg/kg）	FB₃ （μg/kg）	3-ADON （μg/kg）	15-ADON （μg/kg）
33	586.6	/	/	23270.1	55.0	89.2	26.9	126.6
34	785.8	/	/	1162.5	53.1	127.0	18.1	118.0
35	131.4	/	/	5313.0	62.6	147.7	18.0	50.2
38	13530.5	/	/	786.2	58.8	251.8	79.9	365.4
39	2621.3	/	/	1634.8	57.5	200.2	46.2	229.7
40	1008.0	/	/	2399.6	56.9	48.4	38.2	51.3
63	48.5	/	/	1008.7	61.8	172.1	177.6	764.1
69	17.5	/	/	510.9	180.6	320.2	34.4	157.9
70	31.9	/	/	2346.6	68.2	170.6	140.1	1472.2
84	1274.8	/	/	142.0	62.2	94.6	24.1	64.2
85	77.0	/	/	2617.2	59.0	40.1	18.2	59.4
86	508.1	/	/	622.9	68.4	27.9	20.4	80.9
87	106.4	/	/	3667.0	288.0	215.5	65.0	320.7
89	877.4	/	/	3122.5	336.8	275.8	62.4	304.5
90	3653.7	/	/	633.7	125.8	247.2	108.8	489.2
150	2215.5	/	/	1590.6	306.8	359.9	18.7	74.4
182	3834.2	/	/	155.3	79.4	385.4	198.9	849.3
183	203.5	/	/	2261.7	754.3	448.0	20.5	72.1
186	210.3	/	/	1867.3	764.9	485.8	24.1	17.2
187	251.0	/	/	101.5	65.6	433.4	18.6	31.7
190	1740.6	/	/	147.4	87.9	127.0	29.8	122.5
192	292.9	/	/	2661.3	1032.3	147.3	21.9	86.6
196	139.5	/	/	732.1	304.1	133.2	41.3	175.4

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3. 结论

采用QuEChERS技术建立UPLC-MS/MS同时测定玉米中9种真菌毒素的方法，优化了质谱色谱条件，并通过优化提取步骤及净化方法等条件有效减少玉米样品的基质干扰。在0.25～250 μg/L浓度范围内9种真菌毒素相关系数均在0.9999以上，检出限在0.079～1.8 μg/kg之间，定量限在0.26～6.0 μg/kg之间，回收率在80.2%～113.8%之间，相对标准偏差≤7.7%，驻留时间10 min内，9种真菌毒素得到很好分离，该方法操作简单、精密度好、灵敏度高、分析速度快，适用于玉米中9种真菌毒素同时检测，可为农产品中多组分真菌毒素污染风险评估提供参考依据。将优化后方法对240份玉米样品进行检测，结果表明，该批样品中AFTB₁和AFTB₂未有检出，但不同程度检出ZEN、DON、3-ADON、15-ADON、FB₁、FB₂。其中FB₂检出率最高，达到98.3%。表明吉林省玉米存在真菌毒素混合污染问题。

图 1 9种真菌毒素离子流图

注：A为8种真菌毒素混合标准溶液总离子流图，B为ZEN标准溶液离子流图。

Figure 1. Ion flow diagram of 9 fungal toxins

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图 2 9种真菌毒素基质效应散点图

Figure 2. Scatter plots of matrix effects of 9 mycotoxins

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表 1 梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution procedures

时间（min）	流速（mL/min）	甲醇（%）	时间（min）	流速（mL/min）	甲醇（%）
0	0.3	10.0	10.5	0.3	60.0
2.0	0.3	10.0	13.5	0.3	60.0
3.0	0.3	20.0	14.5	0.3	95.0
4.0	0.3	21.0	17.0	0.3	95.0
5.0	0.3	26.0	18.0	0.3	10.0
7.0	0.3	26.0	20.0	0.3	10.0

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表 2 质谱条件

Table 2 Mass spectrum conditions

毒素	扫描模式	保留时间（min）	监测离子对	碰撞能量CE（V）	去簇电压DP（V）
AFTB₁	正	4.0	313/285^*；313/241	31；49	150
AFTB₂	正	3.7	315/287^*；315/259	35；39	150
ZEN	负	6.9	317/175^*；317/131	−32；−38	−140
DON	正	1.9	297/203^*；297/249	22；16	110
3-ADON	正	2.7	339/203^*；339/231	20；16	120
15-ADON	正	2.7	339/137^*；339/231	11；16	120
FB₁	正	5.6	723/334^*；723/352	55；50	150
FB₂	正	6.9	706/336^*；706/318	50；55	150
FB₃	正	7.6	706/336^*；706/318	50；48	150
注：*表示定量离子。

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表 3 方法的线性范围、检出限及定量限

Table 3 Linear range, detection limit and quantitative limit of the method

毒素	标准曲线	线性范围(μg/L)	相关系数(r）	LOD(μg/kg)	LOQ(μg/kg)
ZEN	Y=3003.6 X+4.1×10⁴	6.25～250	0.99998	0.73	2.4
AFTB₂	Y=11183.3 X−2731.5	0.25～10	0.99995	0.079	0.26
AFTB₁	Y=15592.1 X−5794.9	0.50～20	0.99997	0.14	0.48
FB₁	Y=371.1 X−6009.7	6.25～250	0.99991	1.3	4.3
FB₂	Y=551.1 X−6475.4	6.25～250	0.99995	0.26	0.86
FB₃	Y=477.3 X−6153.3	6.25～250	0.99993	1.8	6.0
DON	Y=120.9 X−519.0	6.25～250	0.99993	1.4	4.6
3-ADON	Y=339.3 X−1819.6	6.25～250	0.99998	1.1	3.8
15-ADON	Y=355.4 X−1652.3	6.25～250	0.99999	1.1	3.8

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表 4 9种真菌毒素平均回收率和精密度（n = 6）

Table 4 Average recovery and precision of 9 mycotoxins (n = 6)

毒素	添加量（μg/kg）	平均值（μg/kg）	回收率（%）	RSD（%）
ZEN	250	255.8	102.3	7.7
AFTB₂	10	8.3	83.4	0.2
AFTB₁	20	19.2	95.6	0.5
FB₁	250	227.6	80.2	2.2
FB₂	250	253.9	101.5	0.8
FB₃	250	244.9	97.9	2.9
DON	250	268.4	107.4	7.3
3-ADON	250	284.4	113.8	5.4
15-ADON	250	272.3	108.9	7.6

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表 5 本方法与国标方法对比结果（n = 6）

Table 5 Comparison results between this method and GB method (n = 6)

毒素	测定结果（μg·kg⁻¹）		P
毒素	本方法	国标方法	P
AFTB₁	24.36 ± 0.92	25.53 ± 0.95	>0.05差异不显著
AFTB₂	25.47 ± 1.22	25.89 ± 1.08
ZEN	25.09 ± 1.57	24.59 ± 1.48
DON	25.11 ± 1.75	25.02 ± 1.68
3-ADON	24.70 ± 1.31	25.12 ± 1.14
15-ADON	24.83 ± 1.91	24.72 ± 1.32
FB₁	24.80 ± 0.26	25.42 ± 0.38
FB₂	25.47 ± 0.59	24.74 ± 0.46
FB₃	25.45 ± 0.98	25.51 ± 0.73

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表 6 240份玉米样品中各毒素含量的最大值、最小值及检出率

Table 6 Maximum and minimum values and detection rates of each toxin content in 240 maize samples

毒素	最低检出值（μg/kg）	最高检出值（μg/kg）	检出率（%）
ZEN	9.9	13530.5	14.6
DON	9.5	1806.3	52.9
3-ADON	10.1	205.6	30.4
15-ADON	11.0	1472.2	45.1
FB₁	14.5	23270.1	96.7
FB₂	29.8	5877.1	98.3
FB₃	17.3	3365.5	85.8
AFB1	/	/	/
AFB2	/	/	/
注：/表示未检出。

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表 7 同时检测出5种毒素的玉米样品

Table 7 Maize samples with 5 toxins detected simultaneously

样品编号	ZEN （μg/kg）	AFB₂ （μg/kg）	AFB₁ （μg/kg）	FB₁ （μg/kg）	FB₂ （μg/kg）	FB₃ （μg/kg）	3-ADON （μg/kg）	15-ADON （μg/kg）
33	586.6	/	/	23270.1	55.0	89.2	26.9	126.6
34	785.8	/	/	1162.5	53.1	127.0	18.1	118.0
35	131.4	/	/	5313.0	62.6	147.7	18.0	50.2
38	13530.5	/	/	786.2	58.8	251.8	79.9	365.4
39	2621.3	/	/	1634.8	57.5	200.2	46.2	229.7
40	1008.0	/	/	2399.6	56.9	48.4	38.2	51.3
63	48.5	/	/	1008.7	61.8	172.1	177.6	764.1
69	17.5	/	/	510.9	180.6	320.2	34.4	157.9
70	31.9	/	/	2346.6	68.2	170.6	140.1	1472.2
84	1274.8	/	/	142.0	62.2	94.6	24.1	64.2
85	77.0	/	/	2617.2	59.0	40.1	18.2	59.4
86	508.1	/	/	622.9	68.4	27.9	20.4	80.9
87	106.4	/	/	3667.0	288.0	215.5	65.0	320.7
89	877.4	/	/	3122.5	336.8	275.8	62.4	304.5
90	3653.7	/	/	633.7	125.8	247.2	108.8	489.2
150	2215.5	/	/	1590.6	306.8	359.9	18.7	74.4
182	3834.2	/	/	155.3	79.4	385.4	198.9	849.3
183	203.5	/	/	2261.7	754.3	448.0	20.5	72.1
186	210.3	/	/	1867.3	764.9	485.8	24.1	17.2
187	251.0	/	/	101.5	65.6	433.4	18.6	31.7
190	1740.6	/	/	147.4	87.9	127.0	29.8	122.5
192	292.9	/	/	2661.3	1032.3	147.3	21.9	86.6
196	139.5	/	/	732.1	304.1	133.2	41.3	175.4

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参考文献(25)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理
1.2.2 标准溶液的配制
1.2.2.1 单标溶液的配制
1.2.2.2 混合标准中间液的配制
1.2.2.3 混合标准工作液的配制
1.2.2.4 标准曲线绘制
1.2.3 仪器条件
1.2.3.1 色谱条件
1.2.3.2 质谱条件
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 仪器条件优化
2.1.1 质谱条件优化
2.1.2 色谱条件优化
2.2 方法学考察
2.2.1 方法的线性范围、检出限及定量限
2.2.2 方法的准确度及精密度
2.2.3 基质效应
2.2.4 与国标仪器方法对比
2.2.5 样品检测
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理
1.2.2 标准溶液的配制
1.2.2.1 单标溶液的配制
1.2.2.2 混合标准中间液的配制
1.2.2.3 混合标准工作液的配制
1.2.2.4 标准曲线绘制
1.2.3 仪器条件
1.2.3.1 色谱条件
1.2.3.2 质谱条件
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 仪器条件优化
2.1.1 质谱条件优化
2.1.2 色谱条件优化
2.2 方法学考察
2.2.1 方法的线性范围、检出限及定量限
2.2.2 方法的准确度及精密度
2.2.3 基质效应
2.2.4 与国标仪器方法对比
2.2.5 样品检测
3. 结论

参考文献(25)

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超高效液相色谱-串联质谱法同时测定玉米中9种真菌毒素

作者简介: 谭莉（1991−），女，硕士，主要从事农产品质量安全检测技术方面的研究，E-mail：litan1235@163.com

通讯作者: 魏春雁（1962−），女，博士，研究员，主要从事农产品质量安全方面的研究，E-mail：weichy@yeah.net

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