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中国精品科技期刊2020

复合菌种发酵制备白芸豆多肽工艺优化及其抗氧化活性分析

李思楠, 王萌, 安宇, 王晴, 徐开媛, 王佳, 张智慧, 王玺, 王颖, 张璐

李思楠,王萌,安宇,等. 复合菌种发酵制备白芸豆多肽工艺优化及其抗氧化活性分析[J]. 食品工业科技,2025,46(3):213−221. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024010304.
引用本文: 李思楠,王萌,安宇,等. 复合菌种发酵制备白芸豆多肽工艺优化及其抗氧化活性分析[J]. 食品工业科技,2025,46(3):213−221. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024010304.
LI Sinan, WANG Meng, AN Yu, et al. Process Optimization and Antioxidant Activity Analysis of White Kidney Bean Polypeptides Prepared by Composite Strain Fermentation[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(3): 213−221. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024010304.
Citation: LI Sinan, WANG Meng, AN Yu, et al. Process Optimization and Antioxidant Activity Analysis of White Kidney Bean Polypeptides Prepared by Composite Strain Fermentation[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(3): 213−221. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2024010304.

复合菌种发酵制备白芸豆多肽工艺优化及其抗氧化活性分析

基金项目: 黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目“杂粮主食化食品生产关键技术与高附加值产品开发”(ZDZX202106)。
详细信息
    作者简介:

    李思楠(1998−),女,硕士研究生,研究方向:粮食、油脂及植物蛋白工程,E-mail:lsn980521@163.com

    通讯作者:

    王颖(1979−),女,博士,教授,研究方向:农产品加工与贮藏工程及食品质量安全,E-mail:wychen156@163.com

    张璐(1987−),女,博士,高级工程师,研究方向:功能食品开发与精准营养及功效评价,E-mail:zhanglu8078@126.com

  • 中图分类号: TS201.4

Process Optimization and Antioxidant Activity Analysis of White Kidney Bean Polypeptides Prepared by Composite Strain Fermentation

  • 摘要: 为探究复合菌种发酵制备白芸豆多肽(White kidney bean polypeptides,WKBPs)的最佳工艺条件及体外抗氧化活性,本研究以枯草芽孢杆菌和米曲霉为发酵剂,通过单因素和响应面试验对制备WKBPs的工艺进行优化,利用超滤膜进行分级分离,测定不同分子量WKBPs体外抗氧化活性,筛选活性最好的组分,并结合体外模拟消化体系评价经胃肠消化后WKBPs的体外抗氧化活性变化。结果表明:在发酵时间48 h、温度37 ℃、接种量9%、米曲霉和枯草芽孢杆菌复配比例1:1条件下WKBPs得率为63.47%;超滤后分子量组分WKBPs-4(Mw<3 kDa)具有较好的抗氧化活性;在WKBPs-4浓度在0.2~1.0 mg/mL范围内呈剂量依赖性,抗氧化能力随WKBPs-4浓度的增加而增加,DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羟自由基清除率和Fe3+还原力IC50值分别为0.47、0.50、0.46和0.66 mg/mL;经胃肠消化后WKBPs-4仍保持较高的抗氧化活性,在肠消化终点240 min时,其DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率分别为84.29%和77.34%。本研究可为白芸豆高值利用及精深加工提供理论依据及数据支撑。
    Abstract: In order to investigate the optimal process conditions and in vitro antioxidant activity of white kidney bean polypeptides (WKBPs) from complex strain fermentation, this study used Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae as starter culture, and optimized the process of preparing WKBPs through single factor and response surface experiments. The in vitro antioxidant activity of WKBPs with different molecular weights was determined by ultrafiltration membrane separation, and the most active components were screened. The changes in antioxidant activity of WKBPs after gastrointestinal digestion were evaluated in combination with the simulated digestive system in vitro. The results showed that the yield of WKBPs was 63.47% under the conditions of fermentation time 48 h, temperature 37 ℃, inoculation amount 9% and the ratio of Aspergillus aspergillus and Bacillus subtilis 1:1. The molecular weight component WKBPs-4 (Mw<3 kDa) had good antioxidant activity after ultrafiltration. The concentration of WKBPs-4 was dose-dependent in the range of 0.2 to1.0 mg/mL, and the antioxidant capacity increased with the increase of WKBPs-4 concentration. The IC50 values of DPPH free radical clearance rate, ABTS+ free radical clearance rate, hydroxyl free radical clearance rate and Fe3+ reducing power were 0.47, 0.50, 0.46 and 0.66 mg/mL, respectively. After gastrointestinal digestion, WKBPs-4 still maintained high antioxidant activity. At the end point of intestinal digestion 240 min, the DPPH free radical clearance rate and ABTS+ free radical clearance rate were 84.29% and 77.34%, respectively. This study can provide theoretical basis and data support for high value utilization and deep processing of white kidney beans.
  • 芸豆(Phaseolus vulgaris L.)学名菜豆,又名四季豆[1],是全球范围内普遍种植和消费的豆类之一[2]。芸豆营养丰富,其钙含量是黄豆的2倍,蛋白质含量是小米的3倍[3],同时含有较多的维生素(维生素A、维生素C、维生素E)、矿物质(钾、铁、镁)、膳食纤维和多种人体必需氨基酸,具有一定的食用及药用价值[4]。芸豆中还富含多肽、多酚和多糖等生物活性物质,其中,多肽不仅具备抗氧化[5]、降血压[6]、抗肿瘤[7]和改善心血管功能[8]等生理活性,还因其分子量小、空间结构简单、稳定性高、副作用少、易于人体吸收等优势[9],受到食品和医药行业的广泛关注。目前,芸豆主要以鲜食为主,市场上的深加工产品较少、综合利用率相对较低。

    食源性多肽常采用酶解法和发酵法进行制备[10],但酶制剂价格昂贵、生产成本高,同时酶解后容易产生苦味肽,影响产品口感[11],而发酵是微生物驱动的过程,由于微生物蛋白酶的多样性,可大量水解底物蛋白富集生物活性肽,成本优势明显,此外,发酵生产过程中可以去除肽的苦味,使产品具有更好的口感[12],因此,发酵法广泛用于多肽的制备。研究表明,枯草芽孢杆菌[13]、乳酸菌[14]、酵母菌[15]和曲霉[16]等菌种适用于水解蛋白制备多肽。其中,枯草芽孢杆菌发酵后主要以产内切蛋白酶为主,通过水解切断蛋白质中间肽链以产生小分子多肽[17],米曲霉发酵后主要以产端肽酶为主,切除蛋白质分子的末端氨基酸,达到酶解与脱苦一步到位的目的[18]。由于不同微生物产生蛋白酶的底物特异性,所制备的多肽功能活性也不同。Padhi等[19]采用枯草芽孢杆菌发酵制备赤小豆肽,并鉴定赤小豆水解产物对血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性为45.73%,通过质谱鉴定肽序列结合分子对接技术确定肽段PFPIPPIPPIPLPP和IPFPPIPFLPPI在ACE结合位点表现出良好的结合力。尹乐斌等[20]利用枯草芽孢杆菌发酵豆渣制备大豆多肽,发现在接种量3%、发酵温度37 ℃、发酵时间60 h条件时大豆多肽的得率达到88.12%,并指出大豆多肽具有一定的体外抗氧化性和抑菌性,能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性。龙久铃等[21]以苏麻饼粕为原料利用米曲霉发酵制备多肽,在发酵时间48 h、发酵温度28 ℃、接种量5.5%、料液比1:1条件下,多肽含量为59.97 mg/g,比发酵前增加了2.66倍,DPPH自由基清除率为83.65%,比发酵前增加了0.23倍。然而,目前国内外对于利用复合菌种发酵制备白芸豆多肽(White kidney bean polypeptides,WKBPs)的研究鲜有报道。

    鉴于此,本研究采用枯草芽孢杆菌和米曲霉为发酵剂,通过单因素实验结合响应面法优化WKBPs的复合菌种发酵制备工艺条件,并结合体外模拟消化实验评估WKBPs消化过程中抗氧化活性的变化,以期为芸豆高值化利用和功能食品开发应用提供理论依据。

    白芸豆、黑芸豆、红芸豆、紫花芸豆、奶白花芸豆 黑龙江省齐齐哈尔市富民商贸有限公司;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、米曲霉(Aspergillus oryzae) 中国工业微生物菌种保藏中心;四肽(Gly-Gly-Tyr-Arg)、L-酪氨酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、胃蛋白酶(>250 U/mg)、胰脂肪酶(90 U/mg)、唾液淀粉酶(>5 U/mg)、胰酶(4×USP) 美国Sigma公司;3号胆盐 上海麦克林生化科技股份有限公司;三氯乙酸、双缩脲试剂(AB液)、盐酸 国产分析纯试剂。

    BSA124S高精度精密分析电子天平 德国Sartorius科学仪器有限公司;PHS-25型pH计 青岛明博环保科技有限公司;UV1902PC紫外可见分光光度计 上海奥析科学仪器有限公司;HSX-250恒温恒湿培养箱 上海航配仪器有限公司;Thermo Sorvall ST16高速冷冻离心机 上海土森视觉科技有限公司;BKQ-Z75I高压蒸汽灭菌锅 山东博科科学仪器有限公司。

    5种芸豆的蛋白质、淀粉、水分、灰分和脂肪含量分别依据GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》、GB 5009.9-2023《食品中淀粉的测定》、GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》、GB 5009.4-2016《食品中灰分的测定》和GB 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》进行测定。

    将甘油保存的枯草芽孢杆菌1%接种在LB液体培养基中,于37 ℃、200 r/min的条件下培养12 h,平板划线后于37 ℃培养24 h,刮取一环生长较好的单菌落转接至LB液体培养基中,200 r/min、37 ℃培养24 h后得到放大倍数的菌悬液。米曲霉经斜面活化后刮取一环平板划线接种(30 ℃,96 h)静置培养,用无菌水洗下孢子制备成菌悬液,其中,米曲霉用血球计数板计数,枯草芽孢杆菌用平板计算法计数,调整各菌悬液含菌数为1.0×107 CFU/mL,待用。

    挑取颗粒饱满的白芸豆洗净后烘干,粉碎机粉碎,100目过筛,用蒸馏水将芸豆粉按1:10(m/V)的比例混合,装瓶量30 mL,121 ℃灭菌20 min后冷却,在发酵培养基中接入9%的混合菌液(米曲霉:枯草芽孢杆菌=1:1),37 ℃、180 r/min振荡培养48 h,收集发酵液,1.0×104 r/min −4 ℃低温离心15 min,收集上清液进行冷冻干燥,得到WKBPs粗提物。

    固定其他条件,评估不同发酵时间(24、36、48、60、72 h)、发酵温度(23、30、37、44、51 ℃)、复配比例(3:1、2:1、1:1、1:0、0:1、1:2、1:3)、接种量(3%、6%、9%、12%、15%)对WKBPs得率和蛋白酶活力的影响。

    依据单因素结果,采用中心复合试验设计,利用Design-Expert 8.06软件设计响应面试验,以响应面因素A发酵时间(h);B发酵温度(℃);C接种量(%)为自变量,WKBPs得率(%)为响应值,优化复合发酵工艺参数。试验因素设计与水平见表1

    表  1  响应面试验因素与水平
    Table  1.  Experimental factors and levels of response surface
    水平 因素
    A发酵时间(h) B发酵温度(℃) C接种量(%)
    −1 36 30 6
    0 48 37 9
    1 60 44 12
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    参考姜东[22]的方法,采用双缩脲法测定多肽浓度。以Gly-Gly-Tyr-Arg四肽为标准品,多肽浓度为横坐标x(mg/mL),OD值为纵坐标Y,绘制标准曲线。回归方程为y=0.1234x+0.0253,R2=0.9985。对照标准曲线求得样品溶液中的多肽含量,并根据公式(1)计算WKBPs的粗提取得率。

    (%)=C×Vm×100 (1)

    式中:C:发酵液中多肽浓度(mg/mL);V:发酵液总体积(mL);m:白芸豆蛋白质质量(mg)。

    依据GB/T 28715-2012《蛋白酶活力的测定》,采用福林酚法测定WKBPs蛋白酶活力。以L-酪氨酸为标准品,绘制标准曲线,回归方程为y=0.0101x+0.0094,R2=0.9998。

    使用配有不同超滤膜(3、5、10 kDa)的超滤管对前期制备的白芸豆粗肽进行分级分离,按照分子量大小分为WKBPs-1(Mw>10 kDa)、WKBPs-2(5 kDa<Mw<10 kDa)、WKBPs-3(3 kDa<Mw<5 kDa)、WKBPs-4(Mw<3 kDa)四个组分,将四个组分收集浓缩并冷冻干燥,蒸馏水复溶不同组分WKBPs,配制成1 mg/mL,通过测定体外抗氧化活性(DPPH自由基和ABTS+自由基清除率)筛选最佳组分。

    参考Zhu等[23]的方法略有修改。用无水乙醇制备0.25 mmol/L DPPH溶液,蒸馏水复溶WKBPs-4,配制成不同浓度样品溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)并与DPPH溶液按1:1的比例混合均匀,室温下暗反应30 min,以0.1 mg/mL VC为阳性对照,测定混合溶液在517 nm波长处的OD值。计算如公式(2):

    (%)=(1A1A2A0)×100 (2)

    式中:A1为显色反应后样品溶液的OD值;A2为不加显色剂的OD值;A0为不加样品的OD值。

    参考Xiang等[24]的方法略有修改。取2.9 mL稀释后的ABTS试剂与0.1 mL不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)的WKBPs-4样品溶液混合,室温下避光反应6 min,以0.1 mg/mL VC为阳性对照,在734 nm处测定溶液OD值。计算如公式(2)。

    参考Hui等[25]的方法略有修改。将不同浓度WKBPs-4样品溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)与9 mmol/L FeSO4·7H2O溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液按1:1:1的比例混合,在37 ℃下孵育10 min,然后加入1 mL 9 mmol/L水杨酸溶液,混合均匀,在37 ℃下孵育30 min,以0.1 mg/mL VC为阳性对照,在510 nm处测定溶液OD值。计算如公式(2)。

    参考Gu等[26]的方法略有修改。在1 mL不同浓度WKBPs-4样品溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)中添加2.5 mL 1% K3[Fe(CN)6]和2.5 mL 0.2 mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液,混合均匀,于50 ℃水浴中反应20 min,然后加入2.5 mL 10% TCA终止反应,于4000 r/min离心10 min取上清液,以0.1 mg/mL VC为阳性对照,测定混合溶液(2.5 mL上清液+2.5 mL蒸馏水+0.5 mL FeCl3)在700 nm处的OD值。OD值越大,样品的还原能力越强。

    参照Chen等[27]的方法稍作修改。模拟口腔液:将7500 U唾液淀粉酶加入到100 mL口腔电解质溶液(0.75 mmol/L CaCl2·2H2O、2 mol/L KCl和0.5 mol/L KH2PO4)中,室温搅拌10 min,用2 mol/L NaOH将溶液pH调节至7.0;模拟胃液:将2×105 U胃蛋白酶加入到100 mL胃电解质溶液(0.5 mol/L KCl、1 mol/L NaHCO3、2 mol/L NaCl和0.15 mol/L CaCl2)中,室温搅拌10 min,用2 mol/L HCl将溶液pH调节至2.0;模拟肠液:将5×104 U胰脂肪酶加入到200 mL肠电解质溶液(40 mmol/L胆汁盐、0.5 mol/L KCl、1.5 mmol/L CaCl2·2H2O、0.8%胰液)中,室温搅拌10 min,用2 mol/L NaOH将溶液pH调节至7.0。将1 mg/mL WKBPs样品溶液与口腔消化液1:1(V/V)比例混合,于37 ℃、200 r/min振荡2 min,立即加入2 mol/L HCl调节pH至2.0以停止口腔模拟消化。随后加入10 mL胃液,于37 ℃、200 r/min振荡孵育2 h,随后立即加入2 mol/L NaOH调节pH7.0以停止胃模拟消化。之后于消化体系中加入10 mL肠液,200 r/min、37 ℃振荡孵育2 h。分别于胃消化时间为0、30、60、90、120 min以及肠消化时间为0、30、60、90、120 min时吸取适量样品,于沸水浴中加热10 min进行灭酶处理,5000 r/min离心10 min后取上清液,测定胃肠道消化后WKBPs的抗氧化活性。

    每组实验重复3次,实验结果采用平均值±标准差(X±SD)表示,使用Graphpad Prism 8和Design-Expert.V8.0.6.1软件作图,通过SPSS 20对数据进行统计分析。

    红芸豆、黑芸豆、白芸豆、紫花芸豆和奶白花芸豆5种不同品种的芸豆营养成分含量如表2所示,从中可以看出,与其它品种芸豆相比,白芸豆的蛋白质含量最高为23.94%±0.19%;淀粉和脂肪含量最少,分别为40.69%±0.34%和1.32%±0.06%;水分含量显著低于(P<0.05)黑芸豆、紫花芸豆、奶白花芸豆,为8.44%±0.07%,灰分含量显著低于(P<0.05)黑芸豆,为3.76%±0.02%。以上结果表明,白芸豆是5种芸豆中蛋白质含量最高的豆类,具有较高的营养价值,可用于后续发酵制备WKBPs。

    表  2  芸豆粉营养组成成分分析表(g/100 g)
    Table  2.  Analysis of nutritional components of kidney bean powder (g/100 g)
    样品淀粉脂肪灰分蛋白质水分
    红芸豆42.37±0.11b2.17±0.06a3.49±0.07d22.03±0.11b7.14±0.02e
    黑芸豆41.28±0.10c1.75±0.05c4.13±0.05a22.13±0.15b10.54±0.05b
    白芸豆40.69±0.34d1.32±0.06e3.76±0.02b23.94±0.19a8.44±0.07d
    紫花芸豆42.96±0.88b1.91±0.04b3.84±0.07b20.17±0.12c9.16±0.04c
    奶白花芸豆44.32±0.18a1.54±0.05d3.64±0.04c20.56±0.17c11.46±0.05a
    注:表中不同字母表示不同芸豆间相同的营养成分差异显著(P<0.05)。
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    发酵时间、发酵温度、接种量和复配(米曲霉:枯草芽孢杆菌)比例对WKBPs得率和蛋白酶活力的影响如图1所示。由图1A可知,WKBPs得率和蛋白酶活力随时间的增加而升高,在48 h达到最大值,分别为61.89%和499.10 U/mL,超过48 h后呈下降趋势,这可能是由于在发酵后期,枯草芽孢杆菌与米曲霉生长繁殖进入衰亡期,菌体死亡速度大于菌体繁殖速度,导致产酶能力下降,酶活降低,WKBPs得率减少[28]。因此,选择发酵时间为48 h进行后续实验。

    图  1  单因素实验结果
    注:图中大写字母表示WKBPs得率组内差异显著性(P<0.05),小写字母表示蛋白酶活力组内差异显著性(P<0.05)。
    Figure  1.  Results of single factor experiment

    图1B可知,WKBPs得率和蛋白酶活力随着发酵温度的增加呈先升后降的趋势,在37 ℃时达到最大值,分别为63.24%和511.56 U/mL。微生物生长繁殖与环境温度紧密相关,根据酶促反应动力学,温度升高直接影响微生物反应时间及新陈代谢水平,从而提高其生长速率,但温度过高会导致酶失活,影响蛋白质分解,导致WKBPs得率下降[29]。因此,选择发酵温度为37 ℃进行后续实验。

    图1C可知,WKBPs得率和蛋白酶活力随着接种量增加而升高,接种量为9%时达到最大值,分别为63.21%和518.99 U/mL,接种量超过9%后出现下降趋势。接种量过大导致养分匮乏、菌种无法生长繁殖导致衰退,进而引起产酶量减少,酶活降低,WKBPs得率减少[30]。因此,选择接种量为9%进行后续实验。

    图1D可知,混合菌种比例对米曲霉与枯草芽孢杆菌复合发酵芸豆制备多肽过程中WKBPs得率和蛋白酶活力的影响较为明显,且复合发酵结果优于枯草芽孢杆菌和米曲霉单独发酵。随着枯草芽孢杆菌比例的增加,WKBPs得率和蛋白酶活力呈上升趋势,在米曲霉与枯草芽孢杆菌比例为1:1时达到最大值,分别为62.64%和515.84 U/mL。进一步增加枯草芽孢杆菌的比例,WKBPs得率和蛋白酶活力呈下降趋势,初步分析可能是枯草芽孢杆菌比米曲霉生长发育较快从而消耗了更多的养分,抑制了米曲霉的生长,导致米曲霉分泌蛋白酶的量减少,进而导致酶活降低,WKBPs得率减少[31]。因此,选择混合菌种比例为1:1进行后续实验。

    依据Box-Behnken的中心组合设计,采用Design-Expert 8.0.6.1软件设计3因素3水平共17个试验,以WKBPs得率为响应值(Y,%),试验设计与结果如表3所示。

    表  3  响应面试验设计及试验结果
    Table  3.  Response surface test design and test results
    试验号 A B C Y:WKBPs得率(%)
    1 −1 −1 0 48.16
    2 1 −1 0 52.23
    3 −1 1 0 54.83
    4 1 1 0 55.71
    5 −1 0 −1 50.41
    6 1 0 −1 52.73
    7 −1 0 1 54.14
    8 1 0 1 51.71
    9 0 −1 −1 47.32
    10 0 1 −1 52.83
    11 0 −1 1 51.64
    12 0 1 1 51.91
    13 0 0 0 62.75
    14 0 0 0 63.28
    15 0 0 0 62.65
    16 0 0 0 64.37
    17 0 0 0 64.75
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    表3数据进行多元二次多项式回归拟合,建立复合发酵制备WKBPs的工艺参数回归模型。回归方程为:YWKBPs得率=63.56+0.61A+1.99B+0.76C−0.80AB−1.19AC−1.31BC−4.75A2−6.08B2−6.56C2

    表4所示,对于拟合方程来说,F值通常用于比较模型中的回归(模型拟合的部分)和残差(模型未能解释的部分)的方差,F值越大,说明回归项的方差相对较大,模型的拟合相对较好。模型F值为44.88(P<0.0001),证明该模型达到极显著水平;失拟项是实际观测值与模型预测值之间的差异,失拟项越小,说明模型对数据的拟合越好,失拟项(P=0.2467>0.05)表明差异不显著,说明回归方程适宜;其中,R2=0.9905,表明实验拟合度较好,实验结果与预测值高度一致。校正系数R2Adj=0.9810,说明仅有1.90%的实验因素不能用该模型来表明,R2R2Adj二者之差小于0.2,表明此方程与实际情况拟合良好。分析方差数据可以看出,A、AC、BC对响应面值有显著的影响(P<0.05),B、C对响应面值有高度显著的影响(P<0.01),A2、B2、C2对响应面值有极显著的影响(P<0.0001),其余各项均不显著。根据系数估计绝对值的大小,3个因素对WKBPs得率的影响大小依次为:B(发酵温度)>C(接种量)>A(发酵时间)。可以用该模型分析并确定复合发酵制备WKBPs的最佳工艺参数。

    表  4  响应面回归模型及方差分析结果
    Table  4.  Response surface regression model and analysis of variance results
    方差来源 离差平方和 自由度 均方和 F P 显著性
    模型 535.60 9 59.51 44.88 <0.0001 ***
    发酵时间(A) 2.93 1 2.93 2.21 0.0409 *
    发酵温度(B) 31.72 1 31.72 13.92 0.0018 **
    接种量(C) 4.67 1 4.67 3.52 0.0028 **
    AB 2.54 1 2.54 1.92 0.2085
    AC 5.64 1 5.64 4.25 0.0481 *
    BC 6.86 1 6.86 5.18 0.0470 *
    A2 95.10 1 95.10 71.72 <0.0001 ***
    B2 155.39 1 155.39 117.19 <0.0001 ***
    C2 181.19 1 181.19 136.65 <0.0001 ***
    残差 9.28 7 1.33
    失拟项 5.65 3 1.88 2.07 0.2467
    误差项 3.63 4 0.91
    总和 544.88 16
    R2=0.9905 R2Adj=0.9810
    注:*表示差异显著(P<0.05);**表示差异高度显著(P<0.01);***表示差异极显著(P<0.0001)。
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    发酵时间、发酵温度、接种量对复合发酵制备WKBPs得率影响的响应图如图2所示。响应值随着自变量变化呈整体先增加后下降的趋势,响应面曲线图中存在最大值。AC、BC具有显著交互作用,其曲面有极大值且坡面较陡峭,另外从图中可看出AB也存在一定的交互作用,但并不显著,与表4中二项式回归模型方差分析的结论一致。

    图  2  各因素交互作用对白芸豆WKBPs得率的影响
    Figure  2.  Effects of interaction of various factors on WKBPs yield of white kidney bean

    根据模型通过Design Expert 8.0.6.1软件得到最优条件为:发酵时间48.09 h、发酵温度37.18 ℃、接种量9.13%,WKBPs得率预测值为63.75%。结合实际应用,将实验条件调整为:发酵时间48 h、发酵温度37 ℃、接种量9%,根据上述条件进行验证,得到WKBPs得率的实际值为63.47%,与预测值相近。

    生物活性肽的分子量大小决定了所得到的活性肽是否具有所需的功能特性。超滤是一种压力驱动的膜分离技术,可以将水解产物以分子量为基础分离成多种组分。本实验将WKBPs经超滤后按分子量大小分为4个组分,WKBPs-1(Mw>10 kDa)、WKBPs-2(5 kDa<Mw<10 kDa)、WKBPs-3(3 kDa<Mw<5 kDa)、WKBPs-4(Mw<3 kDa),测定其多肽含量和抗氧化活性,结果如图3所示,各组间存在显著差异(P<0.05),WKBPs-1的肽段含量为1.65%、WKBPs-2的肽段含量为5.78%、WKBPs-3的肽段含量为5.82%、WKBPs-4的肽段含量为86.25%,结果表明,WKBPs分子量主要集中在3 kDa以下。当WKBPs Mw<3 kDa时,抗氧化活性最高,分别为84.22%和82.20%,因此,选择Mw<3 kDa的WKBPs进行后续实验探究。

    图  3  超滤后WKBPs各组分含量及抗氧化活性
    注:图中不同字母表示差异显著(P<0.05),图4图5同。
    Figure  3.  Content and antioxidant activity of WKBPs components after ultrafiltration

    人体正常生长代谢过程中活性氧的产生,会导致自由基合成,而高浓度的自由基会导致氧化应激产生,减少β细胞胰岛素分泌,损害胰岛素信号传导,从而引起2型糖尿病及其并发症。研究表明,抗氧化活性与自由基清除和还原能力呈正相关[32]。本研究以0.1 mg/mL VC为阳性对照,通过DPPH自由基清除、ABTS+自由基清除、羟自由基清除和铁离子还原力测定实验来评估WKBPs的抗氧化能力。

    图4A~C显示了WKBPs的自由基清除率在0.2~1.0 mg/mL范围内呈一定的浓度依赖性,随浓度的增加呈现上升趋势,逐渐接近VC的清除率,表明WKBPs具有良好的抗氧化活性。如表5所示,羟自由基清除率、DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率半抑制浓度(IC50)分别为0.46、0.47和0.50 mg/mL,这一结果与之前报道的绿豆肽[33]和玉米肽[34]自由基清除能力接近。

    图  4  不同浓度WKBPs的抗氧化能力
    Figure  4.  Antioxidant capacity of WKBPs at different concentrations

    Fe3+的还原反应通常用来确定供电子基团的强度,其所反映的还原能力与许多抗氧化机制密切相关。图4D显示了WKBPs和VC对Fe3+的还原能力,结果表明WKBPs的浓度与还原力呈正相关,在0.2~1.0 mg/mL范围内,还原力随浓度的增加呈现不断上升的趋势,相比于VC还原力较低,其IC50为0.66 mg/mL,结果与Zhu等[35]从大豆渣中分离出的低分子量肽的还原能力保持一致。

    表  5  抗氧化活性IC50
    Table  5.  IC50 value of antioxidant activity
    类别IC50(mg/mL)
    DPPH自由基清除率0.47
    ABTS+自由基清除率0.50
    羟自由基清除率0.46
    Fe3+还原能力0.66
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    以WKBPs为研究对象,通过体外模拟胃肠道消化,评估WKBPs在胃肠道消化过程中DPPH自由基和ABTS+自由基清除活性的变化,如图5A~B所示,在胃消化阶段,DPPH自由基和ABTS+自由基清除率随消化时间的增加而升高,120 min胃消化结束时DPPH自由基和ABTS+自由基清除率分别为78.10%和71.49%,在150 min进入肠消化阶段后清除率逐渐趋于稳定,消化结束时清除率分别为84.29%和77.34%。WKBPs胃消化过程中抗氧化活性逐渐增强可能是由于模拟胃消化过程中WKBPs进一步水解成低分子量肽,暴露出更多的氨基酸侧链残基,保持了较高的氧化还原电位,为自由基提供更有效的电子供体[36],增强了生物活性肽的释放,提高了抗氧化活性。进入肠消化阶段,更多小肽的存在,保持了抗氧化活性的稳定性。Zhan等[37]报道了类似的结果,从星油藤(Plukenetia volubilis L.)种子中提取的球蛋白和谷蛋白通过模拟胃肠道消化后释放较小的生物活性肽从而提高了抗氧化能力。

    图  5  体外模拟胃肠消化过程中WKBPs抗氧化活性变化
    Figure  5.  Changes of antioxidant activity of WKBPs during in vitro simulated gastrointestinal digestion

    本研究以白芸豆为原料,经米曲霉和枯草芽孢杆菌复合发酵的方法得到WKBPs得率和蛋白酶活力较高的白芸豆粗肽。以WKBPs得率为响应值,通过单因素结合响应面法得到复合发酵制备WKBPs的最佳工艺参数为:发酵时间48 h、接种量9%、发酵温度37 ℃,在此条件下,WKBPs得率可达到63.47%。超滤结果表明,WKBPs分子量主要集中在3 kDa以下,且分子量<3 kDa的WKBPs抗氧化活性最高,DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羟自由基清除率和Fe3+还原力在WKBPs浓度在0.2~1.0 mg/mL范围内呈剂量依赖性,抗氧化能力随WKBPs浓度的增加而增加,IC50值分别为0.47、0.50、0.46和0.66 mg/mL。在胃肠道消化过程中,WKBPs仍保持较高的抗氧化活性,胃肠消化结束时其DPPH自由基和ABTS+自由基清除率分别为84.29%和77.34%。本研究可为WKBPs的后续工业化生产提供数据和理论支撑,对促进白芸豆产业的精深加工具有重要意义,同时也为抗氧化功能食品的开发提供新的思路。

  • 图  1   单因素实验结果

    注:图中大写字母表示WKBPs得率组内差异显著性(P<0.05),小写字母表示蛋白酶活力组内差异显著性(P<0.05)。

    Figure  1.   Results of single factor experiment

    图  2   各因素交互作用对白芸豆WKBPs得率的影响

    Figure  2.   Effects of interaction of various factors on WKBPs yield of white kidney bean

    图  3   超滤后WKBPs各组分含量及抗氧化活性

    注:图中不同字母表示差异显著(P<0.05),图4图5同。

    Figure  3.   Content and antioxidant activity of WKBPs components after ultrafiltration

    图  4   不同浓度WKBPs的抗氧化能力

    Figure  4.   Antioxidant capacity of WKBPs at different concentrations

    图  5   体外模拟胃肠消化过程中WKBPs抗氧化活性变化

    Figure  5.   Changes of antioxidant activity of WKBPs during in vitro simulated gastrointestinal digestion

    表  1   响应面试验因素与水平

    Table  1   Experimental factors and levels of response surface

    水平 因素
    A发酵时间(h) B发酵温度(℃) C接种量(%)
    −1 36 30 6
    0 48 37 9
    1 60 44 12
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    表  2   芸豆粉营养组成成分分析表(g/100 g)

    Table  2   Analysis of nutritional components of kidney bean powder (g/100 g)

    样品淀粉脂肪灰分蛋白质水分
    红芸豆42.37±0.11b2.17±0.06a3.49±0.07d22.03±0.11b7.14±0.02e
    黑芸豆41.28±0.10c1.75±0.05c4.13±0.05a22.13±0.15b10.54±0.05b
    白芸豆40.69±0.34d1.32±0.06e3.76±0.02b23.94±0.19a8.44±0.07d
    紫花芸豆42.96±0.88b1.91±0.04b3.84±0.07b20.17±0.12c9.16±0.04c
    奶白花芸豆44.32±0.18a1.54±0.05d3.64±0.04c20.56±0.17c11.46±0.05a
    注:表中不同字母表示不同芸豆间相同的营养成分差异显著(P<0.05)。
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    表  3   响应面试验设计及试验结果

    Table  3   Response surface test design and test results

    试验号 A B C Y:WKBPs得率(%)
    1 −1 −1 0 48.16
    2 1 −1 0 52.23
    3 −1 1 0 54.83
    4 1 1 0 55.71
    5 −1 0 −1 50.41
    6 1 0 −1 52.73
    7 −1 0 1 54.14
    8 1 0 1 51.71
    9 0 −1 −1 47.32
    10 0 1 −1 52.83
    11 0 −1 1 51.64
    12 0 1 1 51.91
    13 0 0 0 62.75
    14 0 0 0 63.28
    15 0 0 0 62.65
    16 0 0 0 64.37
    17 0 0 0 64.75
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    表  4   响应面回归模型及方差分析结果

    Table  4   Response surface regression model and analysis of variance results

    方差来源 离差平方和 自由度 均方和 F P 显著性
    模型 535.60 9 59.51 44.88 <0.0001 ***
    发酵时间(A) 2.93 1 2.93 2.21 0.0409 *
    发酵温度(B) 31.72 1 31.72 13.92 0.0018 **
    接种量(C) 4.67 1 4.67 3.52 0.0028 **
    AB 2.54 1 2.54 1.92 0.2085
    AC 5.64 1 5.64 4.25 0.0481 *
    BC 6.86 1 6.86 5.18 0.0470 *
    A2 95.10 1 95.10 71.72 <0.0001 ***
    B2 155.39 1 155.39 117.19 <0.0001 ***
    C2 181.19 1 181.19 136.65 <0.0001 ***
    残差 9.28 7 1.33
    失拟项 5.65 3 1.88 2.07 0.2467
    误差项 3.63 4 0.91
    总和 544.88 16
    R2=0.9905 R2Adj=0.9810
    注:*表示差异显著(P<0.05);**表示差异高度显著(P<0.01);***表示差异极显著(P<0.0001)。
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    表  5   抗氧化活性IC50

    Table  5   IC50 value of antioxidant activity

    类别IC50(mg/mL)
    DPPH自由基清除率0.47
    ABTS+自由基清除率0.50
    羟自由基清除率0.46
    Fe3+还原能力0.66
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图(5)  /  表(5)
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-01-28
  • 网络出版日期:  2024-11-28
  • 刊出日期:  2025-01-31

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