特殊医学用途配方食品（特医食品）是为了满足特殊医学状况或对于特定疾病人群的营养需要而研制的一类特殊膳食食品，当目标人群无法进食普通膳食或无法用日常膳食满足其营养需求时，特殊医学用途配方食品可以作为一种营养补充途径，起到营养支持作用，同时能更好适应特定疾病状态或疾病某一阶段的营养需求，为患者提供有针对性的营养支持，目前其良好的临床效果已得到全世界范围的广泛认可^[1−3]。全营养配方食品是特医食品的一种，由蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质等多种营养素制备而成，可作为单一营养来源满足目标人群营养需求^[4]。其中，针对渐进性消瘦、皮下脂肪减少、水肿及各器官功能紊乱、生长发育和疾病康复缓滞等小儿营养不良症状，以补充1~10岁儿童生长发育足量营养物质（如高蛋白、健康油脂、高维生素等），开发1~10岁全营养特医食品可以满足因消化不足造成的营养不良的1～10岁人群的营养需求，降低营养不良的风险。目前国家市场监督管理总局发布注册的1～10岁人群全营养特医食品营养成分等特性符合GB 29922-2013《特殊医学用途配方食品通则》要求，但整体获批不足10项且多为国外公司品牌，而国内相关研究较少，因此此类产品可作为特医食品的研究模型之一。

N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac），是一种以九碳糖神经氨酸为基本结构的衍生物的总称，因最早由Blix从牛下颌唾液腺蛋白中分离得到的，被称为唾液酸（SA）^[5]。SA作为细胞膜的重要组成成分，广泛存在于生物系统中，有参与神经系统的发育和突触细胞传递的功能^[6]。SA作为婴儿早期生长发育的重要营养物质，主要通过食用母乳获得。母乳中的唾液酸主要以唾液酸低聚糖（14%~33%）的形式存在，有促进大脑发育提升认知能力和记忆力^[7]、保护神经细胞抗神经疾病、改善肠道环境促进肠道对营养素的吸收和抑菌抗毒作用^[8−9]。适用于1～10岁人群的全营养配方食品额外添加SA能够使其营养组成更接近母乳。国家卫生和计划生育委员会已于2017年批准SA作为食品原料^[10]。然而，当前SA在特医食品领域上的应用仍缺乏研究，尤其是对脂肪酸的释放率和脂溶性营养素的生物可及率的影响，这是评价特医食品优劣的重要指标。

在适用于1～10岁人群的全营养配方食品中，脂肪是提供热量和脂肪酸的主要成分，主要以三酰甘油的形式存在，当前研究者常选择将脂溶性营养素添加至脂肪中以进一步强化特医食品的营养性。脂肪摄入人体后，消化主要在小肠中进行，通过胆盐和相关脂肪酶的作用，生成脂肪酸进入线粒体为人体供能，还可以促进脂溶性维生素和多酚的溶解吸收^[11]。脂肪在消化过程中影响因素多种多样主要分为两类：a.脂肪自身状态，其中包括脂肪状态、脂肪结构等；b.消化道内的促氧化环境，主要包括低pH、促氧化物质、活性氧等^[12]。SA作为一种电负性物质，可以与肠道中钙离子等矿物质和一些维生素结合，提高人体对的脂溶性营养素的吸收与利用。此外SA的电负性还可以提高血液中的细胞间的排斥作用，从而减少不必要的细胞间相互作用^[13]。因此，明晰SA对特医食品中脂肪及脂溶性营养素消化特性影响规律，对SA在特医食品领域中的应用较为重要。

本文研究了添加SA对特殊医学全营养配方食品食用品质的影响，通过模拟体外消化，脂肪酸释放率，维生素E的生物可及性，氧化指标等多项指标明确SA对全营养配方食品中脂肪及脂溶性营养素维生素E消化的影响。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

小安素　新加坡雅培制药有限公司；SA　纯度≥98%，嘉必优；粘蛋白、α-淀粉酶（380 U/g）、胃蛋白酶（3000 U/g）、胰酶（2000 U/g）、胰脂肪酶（20000 U/g）、胆汁盐　Sigma公司；正己烷、异丙醇　色谱级　默克股份两合公司；其余试剂均为国产分析纯。

Mastersizer 3000激光粒度仪、ZetaSizer Nano-ZS纳米粒径分析仪　美国马尔文仪器公司；Timao 2.5 pH-STAT消化滴定仪　瑞士万通公司；LSM880激光共聚焦显微镜　德国蔡司； 7890a气相色谱分析仪　安捷伦公司。

1.2   实验方法

1.2.1   脂肪酸组成的测定

参考GB 5009.168-2016^[14]，称取0.3 g小安素粉末于10 mL塑料离心管中，加2 mL正己烷，与超声仪中超声20 min，随后加入3 mL 0.5 mol/L的甲醇钠溶液进行甲酯化，离心（4000 r/min，10 min）取上清液待测。

气相色谱测定条件：Agilent 6890型气相色谱仪，Agilent 7683B自动进样器，氢火焰离子化检测器（FID）。色谱条件：色谱柱HP-INNOWAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气为氮气，流速为1.5 mL/min；进样量为1 μL；进样口温度为260 ℃，分流比为80:1，分流流量为120 mL/min；升温程序：210℃保持9 min，20 ℃/min升至250 ℃，保持10 min，然后运行。

1.2.2   模拟体外消化

体外消化方法采用文献[15−16]方法，样品在消化前现配现用（15 g小安素粉末+100 mL水）。SA组额外加入0.1%的SA（0.015 g），取20 mL溶液在50 mL的离心管中，加入16 mL含粘蛋白的口腔消化液，然后加入100 μL 0.3 mol/L的CaCl₂，调节pH6.8，加入超纯水（1.9-V_NaOH），随后加入2 mL α-淀粉酶溶液，在恒温摇床中孵育2 min。（37 ℃，100 r/min）本阶段α-淀粉酶的酶活为75 U/mL。

取上述20 mL口腔消化液加入16 mL胃消化液，随后用1 mol/L HCl调pH3.0，加入超纯水（2.99-V_HCl），加入10μL CaCl₂，加入1 mL胃蛋白酶，在恒温摇床中孵育2 h。（37 ℃，100 r/min）本阶段胃蛋白酶的酶活为2000 U/mL。

取上述20 mL胃消化后的溶液与8 mL小肠消化液混合，加入3 mL胆汁盐和40 μL CaCl₂，随后用1 mol/L NaOH调pH7.0，加入超纯水（3.96-V_NaOH），加入3 mL胰酶溶液和2 mL胰脂肪酶溶液，在恒温摇床中孵育2 h。（37 ℃，100 r/min）本阶段胰酶的酶活为100 U/mL，胰脂肪酶的酶活为2000 U/mL。

1.2.3   粒径大小及粒径分布的测定

参考Yang等^[17]，利用激光粒度仪通过激光衍射技术，测定原始样品及消化后不同阶段消化液的粒径大小及粒径分布。

1.2.4   Zeta电位的测定

将不同阶段的消化样品采用对应消化液以1:250进行稀释，使用ZetaSizer Nano-ZS纳米粒径分析仪测定消化过程中各个阶段的电位值^[18]。

1.2.5   激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）

参考Cheng等^[19]，制样前先将所有样品稀释至油浓度一致。使用激光共聚焦显微镜的63×油镜检测原始样品及消化过程中各个阶段油脂的微观结构。将200 μL的样品与200 μL超纯水（v/v，1:1）混合。然后，在混合物中加入20 μL尼罗红乙醇溶液（1  mg/mL），分别使用543 nm和605  nm的激发波长和发射波长记录图像。

1.2.6   初级氧化产物含量的测定

参考Meng等^[20]测量氢过氧化物的方法，0.3 mL样品和1.5 mL溶液（异辛烷:异丙醇=3:1）混合，涡旋振荡10 s，重复三次，离心（4000 r/min，10 min）。取200 μL上层有机相和2.8 mL甲醇/丁醇（2:1）混合，随后加入Fe²⁺和硫氰酸铵混合液（1:1）30 μL，混合均匀，在避光条件下孵育20 min，在510 nm波长测量吸光值。使用过氧化氢异丙苯作为标准溶液制备标曲。标曲方程：y=0.0072x+0.0089（其中x为提取液浓度，y为提取液在510 nm测量出的吸光值）；原始样品中初级氧化产物含量计算公式为：

其中，X为提取液浓度；V为提取液体积；W为样品中油脂质量。

1.2.7   次级氧化产物含量的测定

采用Cheng等^[19]测量TBARS的方法对体系中丙二醛含量进行测定，1 mL样品和2 mL TBA试剂充分混合，沸水浴反应15 min，冷却至室温，离心（4000 r/min，10 min），取上清液在532 nm波长测量吸光值。使用1,1,3,3-四乙氧基丙烷配制标准溶液制备标曲。标曲方程：y=0.0554x+0.0023（其中x为上清液浓度，y为上清液在532 nm测量出的吸光值）；原始样品中次级氧化产物含量计算公式为：

其中，X为上清液浓度；V为上清液体积；W为样品中油脂质量。

1.2.8   游离脂肪酸释放率的测定

小肠阶段使用pH-STAT消化滴定仪进行滴定，滴定温度恒定在37 ℃（pH=7），模拟小肠消化测定游离脂肪酸释放率含量。油脂相对分子量的计算方法如下：

其中，${\mathrm{M}}_{\mathrm{甘}\mathrm{油}}$是甘油的分子量为92；${\mathrm{M}}_{\mathrm{脂}\mathrm{肪}\mathrm{酸}}$是小安素中脂肪酸的平均相对分子质量；$3\times 18$是脱去三个水分子的分子量。

脂肪酸释放率计算公式如下^[21]：

其中，${\mathrm{v}}_{\mathrm{N}\mathrm{a}\mathrm{O}\mathrm{H}}$为NaOH的消耗体积（L）；${\mathrm{m}}_{\mathrm{N}\mathrm{a}\mathrm{O}\mathrm{H}}$为NaOH的浓度（mol/L）；${\mathrm{m}}_{\mathrm{l}\mathrm{i}\mathrm{p}\mathrm{i}\mathrm{d}}$为油脂的平均相对分子质量；${\mathrm{w}}_{\mathrm{l}\mathrm{i}\mathrm{p}\mathrm{i}\mathrm{d}}$为消化液中油脂的质量（g）。

1.2.9   维生素E生物可及率的测定

胶束提取：取小肠消化后的溶液进行离心（10000 r/min，1 h）后取上清液即为胶束溶液。采用高效液相色谱测定其中维生素E的含量。

取5 mL样品加入10 mL正己烷涡旋30 min，离心（4000 r/min，10 min），取上清液氮吹，随后加入1 mL正己烷复溶，过0.2 μm滤膜，于棕色样品瓶中待测。

液相色谱分析条件：LC-6AD高效液相色谱，流动相为正己烷:异丙醇=99.5:0.5（V/V），流速1 mL/min，进样量20 μL，温度30 ℃。

根据如下公式计算维生素E的生物可及率^[22]：

其中，${\mathrm{c}}_{\mathrm{胶}\mathrm{束}}$表示胶束中维生素E的浓度；${\mathrm{c}}_{\mathrm{肠}\mathrm{液}}$表示肠液中维生素E的浓度。

根据下述公式计算维生素E在消化过程中的稳定性：

其中，${\mathrm{c}}_{\mathrm{肠}\mathrm{液}}$表示肠液中维生素E的浓度；${\mathrm{c}}_{\mathrm{原}\mathrm{始}}$表示消化前溶液中维生素E的浓度；8表示样品从原始至小肠消化结束稀释的倍数。

1.2.10   分子对接分析

分子对接是一种可以提供相互作用详细信息的理论方法。Discovery Studio（DS）中的CDOCKER 程序是一种半柔性对接算法，采用该程序进行分子对接模拟，研究脂肪酶和唾液酸的相互作用。脂肪酶的三维结构模型从PDB数据库（htps://www.rcsb.org/）下载，其PDB编号为1ETH。从PubChem数据库下载唾液酸的3D结构。将唾液酸结构导入到DS中，设置其pH 为7.0，并采用CHARMm力场优化进一步优化其结构。优化后的脂肪酶与唾液酸被赋予CHARMm力场。采用DS软件进行分子对接，选择能量（-CDOCKER energy、-CDOCKERinteraction energy）最高的对接结果为最优构象并可视化SCG-PB2 间的相互作用^[23]。

1.3   数据处理

所有实验重复操作3次，实验数据的平均值和方差通过Origin 2021分析，数据的显著性差异使用软件SPSS进行分析。

2.   结果与分析

2.1   特医食品的脂肪酸组成

从表1可以看出特医食品中主要包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸，其含量从高到低分别是油酸>亚油酸>棕榈酸>硬脂酸，根据脂肪酸组成可以计算出特医食品中油脂的相对分子质量为877。

表  1  特医食品中油脂的脂肪酸组成

Table  1.  Fatty acid composition of oils and fats in specialty food

样品	棕榈酸（%）	硬脂酸（%）	油酸（%）	亚油酸（%）
特医食品	8.89±1.40b	4.37±1.26a	60.83±0.43d	25.90±2.23c
注：不同字母表示不同脂肪酸含量的比重有显著性差异，P<0.05。

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2.2   SA对特医食品消化前后粒径影响

如图1所示，经过体外模拟消化之后，添加SA与未添加SA的特医食品溶液的粒径变化趋势基本一致，消化后粒径显著增加（P<0.05）。数据显示，消化前的特医食品的粒径D[3,2]为0.84±0.09 μm，添加SA之后在口腔消化液中的粒径下降至0.63±0.04 μm，说明SA促进了特医食品在水中分散。经过口腔消化之后粒径均有一定的提高，发生较小程度的聚集，是因为口腔消化液中的粘蛋白和无机盐产生的屏蔽效应造成的液滴聚集^[24−25]；在胃模拟消化之后液滴发生大程度的聚集，粒径显著增大（P<0.05），可能是因为低表面电荷降低了颗粒间静电排斥，导致液滴发生聚集，胃消化液的酸性环境以及胃蛋白酶的存在破坏了颗粒界面的特性^[26]；在经过肠道消化之后，粒径均进一步增大，主要是由于较高浓度的盐粒子影响产生较大程度的聚集，也可能是因为脂肪的消化和胰酶消化的产物置换造成的液滴聚集^[27]。SA的加入对该特医食品体外消化过程中的粒径变化趋势没有产生明显影响。从图1b~图1c也可以看出，添加SA之后对消化过程中液滴的粒径分布没有产生影响。

图  1  特医食品及特医食品+SA在消化过程中的粒径

注：（a）为消化过程中的粒径变化；（b）~（c）分别为特医食品、特医食品+SA在消化过程中的粒径分布；图（a）中不同小写字母表示同一环境不同样品之间数据差异显著，P<0.05；不同大写字母表示，同一样品不同环境之间数据差异显著，P<0.05；图2同。

Figure  1.  Particle size of special medical food and special medical food+SA during digestion process

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2.3   SA对特医食品消化前后电位的影响

如图2所示，经过口腔消化后溶液的负电荷均显著降低（P<0.05），是因为口腔消化液中的电解质对表面电荷产生的屏蔽作用^[28]。胃消化后电位值进一步下降，主要可能有几个原因：较高离子强度的胃相电解质可以屏蔽静电相互作用^[22]；胃消化液中的胃蛋白酶可以水解溶液中液滴表面的蛋白质，界面膜结构被破坏，降低了溶液中颗粒的稳定性^[16]。在经过小肠消化后负电荷都显著增加（P<0.05），主要是因为小肠消化液中的胆汁盐和脂肪酶改变油滴界面组成，肠道环境使消化液从pH3提高到pH7，一些肠道成分例如胆汁盐、肽和游离脂肪酸，在pH7.0时水解为阴离子状态^[24]。图2中两组样品的电位图对比也可以看出SA的加入对特医食品在模拟体外消化过程中的电位没有显著性影响（P>0.05），可以推测SA的加入没有改变特医食品分散在水中颗粒的界面膜结构。

图  2  特医食品及特医食品+SA在消化过程中的电位

Figure  2.  Potential of special medical food and special medical food+SA during digestion process

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2.4   SA的加入对特医食品消化前后微观形态的影响

从图3中可以看出原始样品溶解状态较好，油滴分布较为均匀，加入SA后分布更加均匀，说明加入SA之后溶液分散的更彻底，在经过口腔消化发生一定程度的聚集，可能是由于口腔消化液中的粘蛋白造成的桥接絮凝^[29]。经过胃部消化2 h之后聚集现象更加明显，粒径增加更明显，主要原因是胃消化环境中的低酸性pH和高离子强度降低了液滴表面的静电排斥力，胃蛋白水解油滴表面的蛋白质造成油滴聚集导致粒径增大^[30]；在经过小肠消化之后几乎没有可观测到的信号，说明大部分油滴已经被脂肪酶分解为游离脂肪酸存在于肠液中。SA的加入对特医食品整个消化过程中的微观结构变化没有明显影响。

图  3  添加SA前后特医食品在不同消化阶段的微观结构

Figure  3.  Microstructure of special medical food at different stages of digestion before and after SA supplementation

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2.5   SA的加入对特医食品消化过程中氧化指标影响

所有样品在消化前和消化过程中均未检测到初级氧化产物（样品吸光值和空白吸光值一致），如表2所示，原始特医食品和添加SA的特医食品TBARS值是0.54 mmol/kg oil，SA的加入对TBARS值的变化趋势几乎没有影响，在经过口腔消化后TBARS值有一定程度的上升达到0.9 mmol/kg oil，在胃和小肠消化后TBARS值没有明显波动，推测可能是因为特医食品中存在V_E等抗氧化剂抑制了消化过程中的氧化发生。SA的加入对于存在促氧化剂的体系可能起到更加明显的效果。

表  2  消化过程中的次级氧化产物（丙二醛）的含量（mmol/kg oil）

Table  2.  Amount of secondary oxidation products (malondialdehyde) during digestion (mmol/kg oil)

样品	原始	口腔	胃部	小肠
特医食品	0.54±0.04a	0.90±0.07a	1.00±0.03a	1.07±0.08a
特医食品+SA	0.54±0.02a	0.87±0.05a	1.00±0.07a	1.07±0.05a
注：不同小写字母表示同列数据差异显著，P<0.05。

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2.6   SA对特医食品中游离脂肪酸释放的影响

从图4中可以看出在消化的前30 min游离脂肪酸的释放速率较快，原始特医食品的脂肪酸释放速率先变慢，并且在120 min时，添加SA组的脂肪酸释放率相比于原始样品显著提高（P<0.05），从76.65%提高到93.10%。FFA的释放的差异可能是由于加入SA之后小安素粉末在溶液中的分散程度更好，有更小的粒径。研究表明较小的液滴具有较大的比表面积，可以使脂肪酶与油脂界面更好的接触，因此具有更高的水解速率和脂肪水解程度^[31]。

图  4  特医食品添加SA前后的游离脂肪酸释放率

Figure  4.  Free fatty acid release rate before and after SA addition to special medical food

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2.7   SA对特医食品中维生素E生物可及率和稳定性的影响

稳定性和生物可及率是评判维生素E生物利用度的重要因素，主要取决于维生素E从油滴内部的释放和在混合胶束中溶解^[32]。从图5中可以看出添加SA前后维生素E的稳定性均在82%左右且没有显著差异（P>0.05）。原特医食品的生物可及性为79.75%，在加入SA后提高到91.96%（P<0.05）。生物可及率提高可能是因为加入SA之后溶液液滴粒径变小，消化的更加彻底，使更多的维生素E进入胶束中被充分的利用^[32]。

图  5  添加SA对特医食品中V_E生物可及率和稳定性影响

注：不同小写字母表示同一指标不同样品差异显著，P<0.05。

Figure  5.  Effect of SA addition on the bioavailability and stability of V_E in special medical foods

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2.8   SA与脂肪酶的分子对接分析

分子对接作为预测两个分子间结合模式的一种有效手段^[33]。根据对接结果参数，选择了对接能（−34.9 kcal/mol）及对接相互作用（−44.3 kcal/mol）最低的构象作为具体的对接分析。由图6a~图6b可知唾液酸插入到了脂肪酶活性空腔，并与众多氨基酸发生了相互作用。如图6c所示，SA可能与脂肪酶的Gly 77，Phe 78，ILE 79，ASP 80，His 152，Ser 153，Leu 154，Phe 216，Trp 253，Arg 257，Val 260，Ala 261，His 264，Leu 265这些氨基残酸发生了作用,形成键长分别为5.50Å、4.62Å、3.92Å、3.67Å的氢键。以上结果表明，SA和脂肪酶可能通过以氢键为主的相互作用连接在一起，从而改变了脂肪酶的空间结构，因此可能影响消化过程中脂肪酶的活性与脂肪酸的释放^[34]。

图  6  SA与脂肪酶的分子对接可视化结果

注：a、b为三维结合模式图；c为二维结合模式图。

Figure  6.  Visualization results of molecular docking between SA and lipase two-dimensional binding mode diagram

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3.   结论

本文主要研究了SA对1~10岁全营养特医食品小安素的消化特性、脂肪酸释放率和维生素E消化情况的影响。结果表明加入SA之后可以促进特医食品在水中的分散，并进一步促进了其模拟消化过程，使脂肪酸释放率提高16.45%，维生素E的生物可及性从79.75%提高到91.64%，分子对接结果表明SA可以通过氢键相互作用改变脂肪酶的空间结构，从而影响脂肪酶活性。本研究说明SA具有应用于1～10岁人群的全营养配方食品中的潜力，它在提高儿童唾液酸摄入的同时，还可以提高脂肪的消化以及脂溶性生物活性物质的生物可及性。后续可通过更加全面的研究，探究在全营养配方的基础上添加唾液酸对不同全营养特医食品营养特性的研究及作用机制，推动我国特殊医学用途全营养配方食品的发展。