Effects of Iron Overload on Liver Injury caused by Different Types of High-fat Diets
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摘要: 目的：探究铁过载联合不同类型高脂膳食对小鼠肝损伤的影响。方法：将48只SPF级雄性C57BL/6J小鼠按体重随机分为6组，每组8只，普通对照组（ND）、高铁对照组（NDFe）给予基础饲料，棕榈油高脂组（PHFD）、棕榈油高脂高铁组（PHFDFe）、大豆油高脂组（SHFD）和大豆油高脂高铁组（SHFDFe）分别给予对应高脂饲料。从第10周开始，NDFe、PHFDFe和SHFDFe组连续8周每周两次肌肉注射右旋糖酐铁100 mg/kg·bw，其余组注射等剂量生理盐水至第17周。麻醉后取血和肝脏，测定小鼠血清和肝脏生化指标、肝脏病理改变及铁代谢和脂代谢相关基因表达。结果：与对应高脂组相比，铁过载联合高脂膳食可使血清总胆固醇（Total cholesterol，TC）、肝脏甘油三酯（Triglyceride，TG）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）水平显著下降（P<0.05），血清TG和谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）水平、肝脏系数、肝脏铁含量和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平显著升高（P<0.05），SHFDFe组肝脏MDA水平显著高于PHFDFe组（P<0.05）。PHFDFe组二价金属转运蛋白1（Divalentmetal-iontransporter-1，DMT-1）和膜铁转运蛋白（Ferroportin，FPN） mRNA表达量显著高于PHFD组（P<0.05）；SHFDFe组FPN mRNA表达量显著高于与NDFe、PHFDFe和SHFD组（P<0.05），乙酰CoA羧化酶1（acetyl-Coenzyme A carboxylase alpha 1，ACC1）和脂肪酸合酶（Fatty Acid Synthase，FASN） mRNA表达量显著低于SHFD组（P<0.05）。结论：铁过载联合高脂膳食会加重脂质代谢紊乱和氧化应激，铁过载联合大豆油高脂饲料喂养导致的肝损伤高于联合棕榈油高脂饲料喂养。Abstract: Objective: To investigate the effects of iron overload in conjunction with different types of high-fat diets on liver injury in mice. Methods: Forty-eight SPF male C57BL/6J mice were randomly divided into six groups based on their body weight (n=8 per group). The normal control group (ND) and normal diet with high iron group (NDFe) were fed with basal diet. The palm oil high-fat diet group (PHFD), palm oil high-fat diet with high iron group (PHFDFe), soybean oil high-fat diet group (SHFD), and soybean oil high-fat diet with high iron group (SHFDFe) were fed with their respective high-fat diets. Starting from the 10th week, mice in the NDFe, PHFDFe, and SHFDFe groups were administered iron dextran through intramuscular injection at a dosage of 100 mg/kg·bw twice a week for 8 consecutive weeks. Meanwhile, the remaining groups were given saline injections of an equal dose until the 17th week. Blood and liver samples were collected after anesthesia to evaluate serum and liver biochemical indexes. Additionally, liver pathological changes were examined, and the expression of genes associated with iron and lipid metabolism was analyzed. Results: Compared with the respective high-fat groups, iron overload in conjunction with high-fat diet significantly decreased serum total cholesterol (TC), hepatic triglyceride (TG) and glutathione peroxidase (GSH-Px) levels while increased serum TG and alanine aminotransferase (ALT), liver index, liver iron and malondialdehyde (MDA) levels (P<0.05). Additionally, liver MDA content of the SHFDFe group was significantly higher than that of the PHFDFe group (P<0.05). Compared with the PHFD group, the mRNA expression levels of Divalentmetal-iontransporter-1 (DMT-1) and Ferroportin (FPN) were significantly increased in the PHFDFe group (P<0.05). FPN mRNA expression level was significantly upregulated in the SHFDFe group when compared with the NDFe, PHFDFe and SHFD groups (P<0.05). Moreover, the mRNA expression levels of acetyl-Coenzyme A carboxylase alpha 1 (ACC1) and Fatty Acid Synthase (FASN) were significantly decreased in the SHFDFe group compared to the SHFD group (P<0.05). Conclusion: The combination of iron overload and high-fat diets has the potential to worsen lipid metabolism disorder and oxidative stress. Additionally, when combined with iron overload, soybean oil may cause more severe liver injury compared to palm oil.
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非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是指除长期大量饮酒和其他明确的损肝因素外所引起的、以甘油三酯为主的脂质在肝细胞中蓄积为病理改变的肝脏代谢性疾病，包括广泛的肝损伤，从单纯的脂肪变性到非酒精性脂肪肝炎和晚期纤维化，最终导致肝细胞癌[1]。据最新报道，全球NAFLD的总体患病率约为32.4%[2]，且患病率逐年升高[3]，已成为当代社会的重大慢性疾病之一。目前，NAFLD的发病机制由“二次打击”学说[4]逐渐向“多重平行打击”学说[5]转变，涉及肝细胞脂肪变性和氧化应激等等，贯穿在疾病不同发生阶段。
膳食宏量营养素，特别是膳食脂肪在NAFLD的发生发展中起关键作用[6]。大豆油是亚洲地区主要的食用油之一，富含多不饱和脂肪酸，而棕榈油则主要含饱和脂肪酸。长期高脂膳食导致肝细胞脂肪变性，且以饱和脂肪酸为主的高脂膳食和以多不饱和脂肪酸为主的高脂膳食对NAFLD疾病发生发展的影响不同[7−9]。研究表明，无论油的类型如何，高脂饮食均有负面影响[10]，不适当油脂摄入可引起体内游离脂肪酸含量增高，导致脂质代谢紊乱，促进NAFLD的发展[11−13]。
铁是人体重要的必需微量元素，参与造血、携带氧气等多种生物学功能。当由于过量补铁等原因导致过多的铁在肝脏、胰腺和心脏等器官中积累，导致这些关键器官的功能障碍，严重影响人们的身体健康，这种情况被称作铁过载[14]。肝脏作为铁最重要的储存器官，当体内存在过多铁时，肝脏会储存铁以减少其他器官铁的储存。研究发现，NAFLD患者的循环铁和储存铁均高于对照组[15]。有证据表明，超过三分之一的NAFLD患者肝脏活检样本显示铁过载[16]。氧化应激是铁过载所致的细胞损伤的关键机制[17]，进入肝细胞的Fe2+通过二价金属转运蛋白1（Divalentmetal-iontransporter-1，DMT-1）进入细胞质内的不稳定铁池（Labile Iron Pool，LIP），LIP中的Fe2+通过Fenton反应产生ROS，进而促进脂质发生过氧化反应。肝脏铁过载促进脂质过氧化，进而促进脂肪变性进展为非酒精性脂肪肝炎、肝硬化或肝癌[18−19]。当肝细胞中同时存在脂肪酸和高浓度的铁，引起脂毒性、氧化应激和炎性反应加剧了肝脏气球样变，加重肝细胞死亡[20]。
目前，铁过载联合高脂膳食对于体内脂质代谢与铁代谢的研究已取得一定进展[21]，研究发现高脂与铁联合作用通过影响肝脏中的β-氧化，加重肝脏内脂质累积，促进NAFLD的发生发展[22−23]。但有研究在高脂饮食的基础上腹腔注射右旋糖酐铁，发现铁过载使小鼠肝脏脂质减少[24]。由此可见，铁过载是否促进高脂膳食诱导的肝脏脂质积累进而促进肝损伤仍存在争议。与此同时，铁过载联合不同类型的高脂膳食造成的肝损伤的研究鲜见报道。本研究通过铁过载联合不同类型高脂膳食，探究铁代谢和脂质代谢对肝损伤的影响，为NAFLD的疾病防治研究提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
SPF级雄性C57BL/6J小鼠 6~8周龄，体质量20±2 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证编号：SCXK（京）2019-0008，饲养于福建医科大学上街校区动物实验中心（福建福州，动物许可证号：SYXK（闽）2022-0003）；右旋糖酐铁注射液 广西化工研究院有限公司兽药厂；0.9%氯化钠注射液 福州海王福药制药有限公司；对照饲料（饲料代码：D12450H，供能比为碳水化合物69.8%、脂肪10.0%和蛋白质20.2%）、棕榈油高脂饲料、大豆油高脂饲料（高脂饲料供能比为碳水化合物34.4%、脂肪45.4%和蛋白质20.2%） 北京科澳协力饲料有限公司；总胆固醇（Total Cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、丙氨酸氨基转移酶（谷丙转氨酶/ALT/GPT）、天门冬氨酸氨基转移酶（谷草转氨酶/AST/GOT）、组织铁试剂盒 南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒 碧云天生物技术有限公司；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒 上海雅酶生物医药科技有限公司；AG RNAex Pro RNA提取试剂、Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒Ver.2、SYBR Green Pro Taq HS 预混型qPCR试剂盒 南京诺唯赞生物技术有限公司。
Reaserch plus微量移液器 德国Eppendorf公司；DK-S26水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；其林贝尔XW-80A旋涡混合器 上海巴玖实业有限公司；TDL-5-A低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂；5702台式低速离心机 德国Eppendorf 公司；Multisakn go酶标仪 美国赛默飞世尔科技有限公司；CFX-96 实时荧光定量PCR仪 美国Bio-Rad公司；ULTRA-TURRA组织匀浆机 德国IKA公司。
1.2 实验方法
1.2.1 动物实验设计
本研究的实验动物方案符合福建医科大学实验动物伦理委员会要求，伦理编号：IACUC FJMU 2022-0596。48只6~8周龄的SPF级的雄性C57BL/6J小鼠在福建医科大学实验动物中心喂养，饲养环境条件：12 h光照/12 h黑暗循环、温度（25±1）℃和相对湿度（50±10）%，适应性喂养7 d后，按体重随机分为6组（n=8）：普通对照组（ND组）、高铁对照组（NDFe组）、棕榈油高脂组（PHFD组）、棕榈油高脂高铁组（PHFDFe组）、大豆油高脂组（SHFD组）、大豆油高脂高铁组（SHFDFe组）。ND组和NDFe组给予对照饲料，PHFD组和PHFDFe组给予棕榈油高脂饲料，SHFD组和SHFDFe组给予大豆油高脂饲料。根据课题组前期报道[21,25]，选择连续喂养17周，NDFe组、PHFDFe组和SHFDFe组从实验第10周开始按照100 mg/kg·bw剂量进行右旋糖酐铁肌肉注射，连续8周，每周两次，左右后腿交替。对照组注射等剂量0.9%氯化钠注射液直至第17周实验结束。每周记录体重，实验期间各组小鼠自由摄食和饮水。
1.2.2 小鼠体重及肝重的测定
小鼠在适应性喂养7 d后称重，记录初体重，小鼠在处死前一天称重，记录终体重。解剖小鼠，分离取肝脏，生理盐水漂洗去除积血，拭净后称重并记录，根据下式计算其肝脏系数[26]：
$$ 肝脏系数(\text{%})=\frac{肝脏重量(\text{g})}{小鼠体重(\text{g})}\times 100 $$ 1.2.3 血清生化指标测定
实验结束前一天禁食不禁水12 h，干冰麻醉后心脏取血，全血室温下放置30~60 min后，4 ℃、3000 r/min离心10 min，小心吸取上清液存于−80 ℃。测定血清TC、TG、ALT、AST水平，具体方法严格按照相应试剂盒说明书进行。
1.2.4 肝脏病理学检测
解剖后取小鼠肝脏拍照做形态学分析，选取小鼠肝脏同一部位泡入4%多聚甲醛组织固定液内，石蜡包埋、切片、烤片、脱蜡后进行HE染色[26]，封片在光学显微镜下观察肝脏病理变化，并拍照留存，采集倍数200×。
1.2.5 肝脏生化指标测定
取选肝右叶按1:9（mg:mL）比例加入冰冷生理盐水（0.9%NaCl），加入磁珠，在组织匀浆机中研磨60 s至肉眼不见纤维颗粒，4 ℃、12000 r/min离心10 min，吸取上清液。采用BCA法进行蛋白定量，定量后测定肝脏TG含量、铁含量、GSH-Px水平、MDA含量，具体方法严格按照相应试剂盒说明书进行。
1.2.6 qRT-PCR检测DMT-1、膜铁转运蛋白（Ferroportin，FPN）、乙酰CoA羧化酶1（acetyl-Coenzyme A carboxylase alpha 1，ACC1）、脂肪酸合酶（Fatty Acid Synthase，FASN）基因的表达
利用RNAex裂解液，充分匀浆后提取总RNA。使用Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒Ver.2合成为cDNA后存于−20 ℃保存备用。使用SYBR Green Pro Taq HS 预混型qPCR试剂盒进行荧光定量PCR，于Bio-Rad实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应，扩增条件：95 ℃预变性30 se，95 ℃预变性5 sec，60 ℃退火并延伸30 sec，共40 个循环。引物序列见表1。相对 mRNA 水平归一化为内源性控制基因β-actin，采用2−△△CT法来分析指标的表达情况[27]。
表 1 DMT-1、FPN、ACC1、FASN mRNA 引物序列Table 1. Sequences of DMT-1, FPN, ACC1, FASN mRNA primers基因 正向引物 反向引物 产物长度（bp） β-actin ATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC ATGGAGCCACCGATCCACA 120 DMT-1 TGAAGTATGTCACCGTCAGTATCC GTCAGAACCAATGATTGCCAACT 82 FPN GGTCCTTACTGTCTGCTACATCCT CTCCTGCCACAACAACAATCCA 113 ACC1 GCCTCCAACCTCAACCACTATG TCACAGAAGCAGCCCATTATTTCA 167 FASN CCGTGTGACCGCCATCTATA TGCTGTCGTCTGTAGTCTTGAG 154 1.3 数据处理
所有数据采用SPSS 26.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准误（mean±SEM）表示，各指标数据经过正态性检验和方差齐性检验，两组样本间比较采用独立t检验，分析各组间差异，P<0.05表示差异具有显著性。采用GraphPad 8.0.2软件对数据进行分析处理并作图。
2. 结果与分析
2.1 对小鼠一般指标的影响
2.1.1 体重
如图1A所示，各组小鼠初始体重无显著性差异（P>0.05），图1B为干预17周后的小鼠终体重，与ND组相比，NDFe组体重差异不具有显著性（P>0.05），PHFD组和SHFD组的终体重显著升高且PHFD组显著高于SHFD组（P<0.05），SHFDFe组和SHFD组相比、PHFDFe组和PHFD组相比体重显著下降（P<0.05），SHFDFe组体重显著低于PHFDFe组（P<0.05）。以上结果表明，不同类型高脂膳食导致的体重升高程度有所不同，与以不饱和脂肪酸为主的大豆油高脂膳食相比，以饱和脂肪酸为主的棕榈油高脂膳食引起的体重增加效果更显著，而铁过载联合不同类型高脂膳食导致小鼠体重下降且在不同高脂高铁组间存在差异。
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2.1.2 肝脏系数
如图1C所示，与ND组相比，高脂组（PHFD组与SHFD组）小鼠肝脏系数没有显著差异（P>0.05），说明高脂膳食对小鼠的肝重无显著影响，注射右旋糖酐铁导致铁干预组（NDFe组、PHFDFe组、SHFDFe组）小鼠肝脏系数均显著升高（P<0.05），说明通过肌肉注射的铁通过体循环进入体内，在肝脏大量蓄积，导致肝重增加。
2.2 对小鼠血清指标的影响
如图2A所示，与ND组相比，PHFD组和SHFD组小鼠血清TC水平显著升高（P<0.05），而PHFDFe组与PHFD组相比、SHFDFe组与SHFD组相比，血清TC水平显著降低（P<0.05），PHFDFe组血清TC水平显著高于SHFDFe组（P<0.05）；图2B所示为小鼠血清TG水平，与ND组相比，NDFe组和SHFD组血清TG水平显著升高（P<0.05），与PHFD组相比，PHFDFe组的TG水平显著升高（P<0.05）；图2C为血清ALT水平，与ND组相比，NDFe组和SHFD组显著升高（P<0.05），PHFD组升高但不具有显著性差异（P>0.05），与各自对照组相比，铁干预组小鼠的ALT水平显著升高（P<0.05）；图2D表明，各组的血清AST水平组间差异不具有统计学意义（P>0.05）。以上结果表明，单纯铁过载或高脂膳食都会导致血脂异常以及肝损伤，但铁过载联合高脂膳食会导致更严重的肝损伤。
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图 2 铁过载联合不同类型高脂膳食对C57BL/6J小鼠血清生化的影响（n=8）注：（A）血清总胆固醇（TC）水平；（B）血清甘油三酯（TG）水平；（C）血清谷丙转氨酶（ALT）活性；（D）血清谷草转氨酶（AST）活性。Figure 2. Effects of iron overload in conjunction with different types of high-fat diets on serum biochemistry in C57BL/6J mice (n=8)2.3 对小鼠肝脏组织病理学的影响
2.3.1 对小鼠肝脏大体形态的影响
如图3A所示，干预结束后，ND组小鼠肝脏色泽红润，表面光滑无结节，质地柔软，PHFD组肝叶变厚，体积变大，颜色变浅发黄，质地饱满，表面可见细小的颗粒状结构，SHFD组肝脏颜色略有变浅发黄；NDFe组、PHFDFe组、SHFDFe组小鼠肝脏颜色加深，表面粗糙。
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图 3 铁过载联合不同类型高脂膳食对C57BL/6J小鼠肝脏组织病理学的影响注：（A）肝脏形态；（B）肝脏HE染色（200×）。Figure 3. Effects of iron overload in conjunction with different types of high-fat diets on liver histopathology in C57BL/6J mice2.3.2 对小鼠组织病理学的影响
如图3B所示，ND组小鼠肝小叶结构清晰可辨，肝索排列整齐，胞内无明显的空泡；PHFD组和SHFD组出现明显脂肪变性（黑色三角形所示），胞浆中存在许多大小不等的空泡，PHFD组脂肪变性程度高于SHFD组；NDFe组、PHFDFe组、SHFDFe组出现不同程度的炎性细胞浸润并且有铁血黄素沉着（空心三角形所示），即大量巨噬细胞吞噬降解红细胞血红蛋白所产生的铁蛋白微粒聚集体，系Fe3+与蛋白质结合而成，镜下观察为褐色颗粒，是铁蓄积的重要标志（黑色箭头所示）。
2.4 对小鼠肝脏生化指标的影响
如图4A所示，PHFD组TC水平显著高于SHFD组（P<0.05），PHFDFe组TC水平显著低于NDFe组（P<0.05），SHFDFe组TC水平显著高于SHFD组（P<0.05），大豆油高脂高铁导致肝脏TC水平升高。如图4B所示，与ND组相比，PHFD组肝脏TG水平显著升高且显著高于SHFD组（P<0.05），SHFD组TG水平无显著性差异（P>0.05），NDFe组与ND组相比、PHFDFe组与PHFD组相比、SHFDFe组与SHFD组相比，TG水平均显著降低（P<0.05），但铁干预组组间差异不显著（P>0.05），说明富含棕榈油的高脂膳食导致肝脏TG水平升高，铁过载导致肝脏TG水平降低。图4C所示为小鼠肝脏铁含量，与各自对照组相比，铁干预组肝脏铁含量显著升高（P<0.05），说明通过肌肉注射的右旋糖酐铁会导致肝内铁蓄积。图4D为小鼠肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活性（GSH-Px），GSH-Px水平反映抗氧化程度，与ND组相比，NDFe组、PHFD组、SHFD组的GSH-Px水平均显著降低，PHFD组与PHFDFe组相比、SHFD组与SHFDFe组相比，GSH-Px水平均显著升高（P<0.05）。图4E为小鼠肝脏MDA含量，MDA是自由基与脂质间过氧化的最终产物，可以直接反映脂质的氧化程度。MDA含量在各组间存在显著差异，与ND组相比，NDFe组、PHFD组、SHFD组均不同程度显著升高且SHFD组显著高于PHFD组（P<0.05），PHFDFe组与PHFD组相比，SHFDFe组与SHFD组相比，MDA含量均显著升高（P<0.05），NDFe组、PHFDFe组和SHFDFe组三组间MDA含量存在显著差异（P<0.05），SHFDFe组MDA含量最高。以上结果表明，铁过载和高脂膳食都降低了小鼠的抗氧化能力并导致脂质过氧化，铁过载联合高脂膳食与单纯的铁过载或高脂膳食相比，会进一步加重肝损伤，其中铁过载联合大豆油高脂膳食导致抗氧化能力降低以及脂质过氧化程度最高，可能导致最严重的肝损伤。
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图 4 铁过载联合不同类型高脂膳食对C57BL/6J小鼠肝脏生化的影响（n=8）注：（A）肝脏总胆固醇水平（TC）；（B）肝脏甘油三酯水平（TG）；（C）肝脏铁含量；（D）肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性；（E）肝脏丙二醛（MDA）水平。Figure 4. Effects of iron overload in conjunction with different types of high-fat diets on liver biochemistry in C57BL/6J mice (n=8)2.5 小鼠肝脏组织铁转运通路相关基因相对表达量
肝细胞中DMT1和FPN负责铁的转运，其mRNA表达量如图5所示，与ND组相比，NDFe组、SHFD组DMT-1 mRNA表达量升高但差异不显著（P>0.05），与PHFD组相比，PHFDFe组DMT-1 mRNA表达量显著升高（P<0.05），与SHFD组相比，SHFDFe组DMT-1 mRNA表达量降低但差异不具有显著性（P>0.05），SHFDFe组显著低于PHFDFe组（P<0.05）。与ND组相比，PHFD组和SHFD组FPN mRNA表达量降低但差异不具有显著性（P>0.05），与各自对照组相比，铁干预组FPN mRNA表达量均显著升高且SHFDFe组显著高于NDFe组和PHFDFe组（P<0.05）。结果表明，铁过载导致肝细胞中进入和排出的铁含量均有所升高，当肝脏处于铁过载的情况下，棕榈油高脂膳食使转运铁含量增加，铁外排也相对增加，大豆油高脂膳食不会转运入更多的铁，但会增加铁的外排。
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图 5 铁过载联合不同类型高脂膳食对C57BL/6J小鼠肝脏DMT-1（A）和FPN（B）基因表达的影响Figure 5. Effects of iron overload in conjunction with different types of high-fat diets on hepatic DMT-1 (A) and FPN (B) mRNA expression levels in C57BL/6J mice2.6 小鼠肝脏组织脂质合成相关基因相对表达量
小鼠肝脏脂质合成可能受到影响，因此检测脂质合成相关基因ACC1和FASN（图6）。与ND组相比，NDFe组ACC1和FASN mRNA表达量降低但差异不具有显著性（P>0.05），PHFD组ACC1和FASN mRNA表达量升高但差异不具有显著性差异（P>0.05），SHFD组ACC1 mRNA表达量显著升高（P<0.05）。与PHFD组相比，PHFDFe组ACC1和FASN mRNA表达量降低但差异不显著（P>0.05），SHFD组ACC1和FASN mRNA显著升高（P<0.05）。与SHFD组相比，SHFDFe组ACC1和FASN mRNA表达量显著降低（P<0.05）。结果表明，棕榈油高脂膳食导致的肝脏脂质积累可能与ACC1和FASN关系较小，铁过载联合棕榈油高脂膳食导致肝脏脂质减少。虽然使ACC1和FASN表达有所降低但差异不具有显著性，说明ACC1和FASN在以棕榈油为主的高脂膳食中发挥作用可能较小，大豆油高脂膳食通过ACC1和FASN表达量增加，导致脂质过氧化物生成增多，而铁过载联合大豆油高脂膳食导致的肝脏脂质减少可能与ACC1和FASN有关，其机制有待进一步研究。
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图 6 铁过载联合不同类型高脂膳食对C57BL/6J小鼠肝脏ACC1（A）和FASN（B）基因表达的影响Figure 6. Effects of iron overload in conjunction with different types of high-fat diets on hepatic ACC1 (A) and FASN (B) mRNA expression levels in C57BL/6J mice3. 讨论与结论
本实验经高脂饮食诱导已成功建立NAFLD模型，进一步通过肌肉注射右旋糖酐铁构建了铁过载小鼠模型。铁过载联合不同类型高脂膳食通过抑制肝脏脂质水平，加重了氧化应激从而促进了NAFLD发生发展，这与文献中报道的铁过载联合高脂膳食对肝脏脂质代谢的结果相似[24]。另一方面，大豆油高脂高铁组的肝脏MDA含量显著高于棕榈油高脂高铁组，表明大豆油高脂高铁可能造成更严重的肝损伤。
FPN是目前哺乳动物细胞中唯一已知的铁输出基因，其主要生理功能是将Fe2+外排进血液中[28]，其表达高低直接关系到细胞内外的铁水平[29]。因此检测铁代谢转运通路上的DMT-1和FPN基因表达量可判断肝脏铁代谢是否异常。本实验结果表明，不同类型高脂膳食对铁代谢的影响不显著，但铁过载联合棕榈油高脂膳食促进了DMT-1表达，LIP内Fe2+增加，FPN表达增加，促进肝脏铁的外排；铁过载联合大豆油高脂膳食不改变DMT-1表达，但FPN表达增加且高于棕榈油高脂高铁，表明肝脏铁的外排增加。结果表明当存在肝脏铁过载时，棕榈油高脂高铁可能会加重肝脏铁蓄积，而大豆油高脂高铁使肝细胞外铁水平增加，可能会促进血液内铁含量增加。
脂质合成是NAFLD疾病发生发展中的重要部分，ACC1是定位于细胞质中的脂质合成代谢的关键酶，其生成的丙二酰CoA用于脂肪酸合成[30]；FASN是调节脂肪酸从头合成途径中的关键酶，过表达导致大量脂肪酸合成[31]。本研究检测肝脏ACC1和FASN水平发现，不同类型高脂高铁状况下，机体对脂质合成的具体机制有所不同，铁过载联合棕榈油高脂膳食导致的肝脏TG改变可能与ACC1和FASN无关；铁过载联合大豆油高脂膳食可能通过降低ACC1和FASN的表达从而导致肝脏TG水平降低，大豆油富含多不饱和脂肪酸，进而促进脂质过氧化，加重肝脏氧化应激和脂质过氧化物的生成，导致肝损伤。结果表明，大豆油高脂高铁与棕榈油高脂高铁导致肝脏TG水平降低的所影响的基因可能是不同的。
综上所述，本研究认为铁过载联合以多不饱和脂肪酸为主的高脂膳食可能会导致比铁过载联合以饱和脂肪酸为主的高脂膳食更严重的肝损伤。铁过载和高脂膳食构成NAFLD的“多重平行打击”发病机制中的重要部分，通过调节脂质合成，促进氧化应激与脂质过氧化物生成，进而促进肝损伤，研究为揭示在肝脏中不同高脂状态对铁过载的不同效应，从而为预防和治疗NAFLD及其伴随的代谢性疾病的发病机制研究提供思路与线索。
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图 2 铁过载联合不同类型高脂膳食对C57BL/6J小鼠血清生化的影响（n=8）
注：（A）血清总胆固醇（TC）水平；（B）血清甘油三酯（TG）水平；（C）血清谷丙转氨酶（ALT）活性；（D）血清谷草转氨酶（AST）活性。
Figure 2. Effects of iron overload in conjunction with different types of high-fat diets on serum biochemistry in C57BL/6J mice (n=8)
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图 3 铁过载联合不同类型高脂膳食对C57BL/6J小鼠肝脏组织病理学的影响
注：（A）肝脏形态；（B）肝脏HE染色（200×）。
Figure 3. Effects of iron overload in conjunction with different types of high-fat diets on liver histopathology in C57BL/6J mice
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图 4 铁过载联合不同类型高脂膳食对C57BL/6J小鼠肝脏生化的影响（n=8）
注：（A）肝脏总胆固醇水平（TC）；（B）肝脏甘油三酯水平（TG）；（C）肝脏铁含量；（D）肝脏谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性；（E）肝脏丙二醛（MDA）水平。
Figure 4. Effects of iron overload in conjunction with different types of high-fat diets on liver biochemistry in C57BL/6J mice (n=8)
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图 5 铁过载联合不同类型高脂膳食对C57BL/6J小鼠肝脏DMT-1（A）和FPN（B）基因表达的影响
Figure 5. Effects of iron overload in conjunction with different types of high-fat diets on hepatic DMT-1 (A) and FPN (B) mRNA expression levels in C57BL/6J mice
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图 6 铁过载联合不同类型高脂膳食对C57BL/6J小鼠肝脏ACC1（A）和FASN（B）基因表达的影响
Figure 6. Effects of iron overload in conjunction with different types of high-fat diets on hepatic ACC1 (A) and FASN (B) mRNA expression levels in C57BL/6J mice
表 1 DMT-1、FPN、ACC1、FASN mRNA 引物序列
Table 1 Sequences of DMT-1, FPN, ACC1, FASN mRNA primers
基因 正向引物 反向引物 产物长度（bp） β-actin ATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC ATGGAGCCACCGATCCACA 120 DMT-1 TGAAGTATGTCACCGTCAGTATCC GTCAGAACCAATGATTGCCAACT 82 FPN GGTCCTTACTGTCTGCTACATCCT CTCCTGCCACAACAACAATCCA 113 ACC1 GCCTCCAACCTCAACCACTATG TCACAGAAGCAGCCCATTATTTCA 167 FASN CCGTGTGACCGCCATCTATA TGCTGTCGTCTGTAGTCTTGAG 154 
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