类胡萝卜素（carotenoids）是一类重要天然色素的总称，广泛存在于动物、高等植物、藻类和微生物中^[1]。根据分子结构可将其分为两大类^[2]：一类不含氧元素，如β-胡萝卜素；另一类则可形成含氧官能团，如虾青素和叶黄素^[3]，三种类胡萝卜素的分子结构见图1。类胡萝卜素具有众多生理功效，在抗氧化^[4]、抗炎^[5]、抗癌^[6]、调节免疫^[7]以及预防心血管疾病^[8]等方面效果显著，在食品、医药、生物和化工等领域中均发挥着重要作用^[9-11]。但是，类胡萝卜素的水分散性差和不稳定等特点，限制了其广泛应用^[12]，并且在一定的水合有机体系中，类胡萝卜素分子可发生自聚集，形成不同于单体的聚集体（H聚集体或J聚集体），直接关系到其功能的发挥。

图  1  三种类胡萝卜素结构图

Figure  1.  Structure of three carotenoids

下载: 全尺寸图片 幻灯片

Judith等^[13]的研究表明类胡萝卜素分子在水合有机体系中可形成不同类型的聚集体，区分不同聚集体最直观的表现在于颜色，如H聚集体-虾青素乙醇溶液为浅黄色、J聚集体-虾青素乙醇溶液为粉紫色等^[14-15]。此外，在紫外可见光谱中，相对于单体而言，光谱蓝移则为H聚集体，光谱红移则为J聚集体^[16-17]。不同类胡萝卜素由于分子结构的不同可形成的聚集体类型和难易程度不同，如虾青素和β-胡萝卜素可形成H聚集体和J聚集体，叶黄素仅能形成H聚集体。而分子间的范德华力、静电相互作用、疏水相互作用、氢键力等相互作用是形成聚集体的原因^[18-19]。在影响聚集类型的因素中，水合有机体系中含水量的多少对聚集体的形成至关重要，含水量多易形成H聚集体^[20]。

食品、药品、化妆品和生物体中含有一定量的水，其影响着聚集体的类型，而聚集体的理化性质和光学特性不同于单体分子^[18]，且H聚集体的层状特征和J聚集体的纤维状结构的形成可改善类胡萝卜素的水分散性^[21-22]，有利于类胡萝卜素更好地应用于食品、医药和化妆等领域。脂溶性类胡萝卜素具有多种有益的生理活性，但其在加工或存储过程中分子单体和聚集体间的变化规律目前还未有深入的研究报道。因此，研究类胡萝卜素聚集体的形成和稳定性，单一可控制备类胡萝卜素聚集体（H聚集体、J聚集体或M单体）具有重要意义。

本文选择虾青素、叶黄素和β-胡萝卜素作为类胡萝卜素典型代表，探究水合有机溶剂不同比例和不同加样顺序对类胡萝卜素聚集体的形成类型、形成条件和稳定性的影响。本实验用乙醇或丙酮溶剂溶解类胡萝卜素，通过改变含水量，在两种不同加样顺序下基于紫外可见光谱法探究水合有机体系中类胡萝卜素的存在状态（H聚集体、J聚集体和M单体）、形成条件和稳定性。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

虾青素　纯度99%，购于上海阿拉丁（Aladdin）生化科技股份有限公司；叶黄素　纯度90%，购于北京索莱宝（Solarbio）科技有限公司；β-胡萝卜素　纯度99%，购于北京索莱宝（Solarbio）科技有限公司；丙酮、无水乙醇　采用国产分析纯度试剂。

UV-3100紫外可见分光光度计　上海美谱达仪器有限公司；AMM-6T多位点加热磁力搅拌器　天津奥特赛恩斯仪器有限公司；MJ-78A高压灭菌锅　施都凯仪器设备（上海）有限公司；DHG9140A电热恒温鼓风干燥箱　上海-恒科学仪器有限公司。

1.2   实验方法

1.2.1   类胡萝卜素溶液的配制

精密称取2.5 mg虾青素、β-胡萝卜素粉末分别溶于50 mL丙酮中；精密称取2.5 mg叶黄素粉末溶于50 mL乙醇中，在室温避光条件下，转速200 r/min，磁力搅拌至少1 h，分别得到浓度为0.05 mg/mL的各类胡萝卜素溶液，存放于4 ℃冰箱，以备使用。

1.2.2   类胡萝卜素溶液标准曲线制作

将1.2.1中制备的类胡萝卜素溶液按梯度分别稀释至0.001~0.01 mg/mL，根据朗伯-比尔定律的使用条件，吸光度在0.2~0.8之间^[23]。根据定律，溶液浓度不同时，光吸收曲线的形状相同，λ_max不变，只是吸光度与浓度成正比关系变化。在489 nm处测定不同浓度虾青素丙酮溶液的吸光度，建立的回归方程为y=321.88x−0.0253，R²=0.99。在452 nm下测定不同浓度叶黄素乙醇溶液的吸光度，建立的回归方程为y=166.73x−0.0118，R²=0.9977。在454 nm处测定不同浓度β-胡萝卜素丙酮溶液的吸光度，建立的回归方程为y=188.75x−0.0018，R²=0.9976。以上三种溶液在一定范围内线性关系良好，说明标准曲线准确度高。

1.2.3   类胡萝卜素有机-水混合溶液的制备

参考Giovannetti等^[17]、Subramanian等^[21]和Zajac等^[24]的实验方法，将制备好的1.2.1中虾青素、叶黄素、β-胡萝卜素溶液分别稀释，按照有机溶液占总体积比为10%，20%……90%，将水滴入不同浓度的类胡萝卜素有机溶液中，保证每份溶液中类胡萝卜素含量均为4 mg，并控制每种类胡萝卜素最终样品的体积一致，确定每个样品中类胡萝卜素的最终浓度所对应的吸光度在朗伯-比尔定律规定的最适范围内。用相同的方法，再将不同浓度的类胡萝卜素有机溶液滴入水中。

1.2.4   类胡萝卜素混合溶液的紫外可见吸收光谱测量

取制备好的类胡萝卜素混合溶液利用紫外可见分光光度计对其在紫外可见光区进行300~800 nm的全波长扫描。打开紫外可见分光光度计预热15 min，取1.2.2和1.2.3的样品加入样品皿，以蒸馏水为参比，设置波长间隔为1.0 nm，光程为1 cm，进行光谱扫描，观察0 h不同样品的光谱特征。

1.2.5   类胡萝卜素混合溶液的稳定性研究

取1.2.4测量后的样品，在室温（25 ℃）条件下放置24、48 h，按照1.2.4相同的方法对样品进行光谱扫描，观察不同样品的光谱特征。通过样品在0、24、48 h的紫外可见吸收光谱图，对比分析其吸收峰的峰形、峰值变化和稳定性。

1.3   数据处理

本实验数据均采用三次平行实验取平均值，采用Excel或者Origin等画图软件绘制紫外可见吸收光谱图，并将同种类胡萝卜素溶液0、24和48 h的紫外可见吸收光谱图绘制组合，观察其吸收峰。

2.   结果与分析

2.1   类胡萝卜素溶液状态

依照1.2.3中方法制备出的三种类胡萝卜素溶液样品图如图2所示。通过改变水与有机相的比例和加样顺序制得的样品均澄清透明、无絮凝、无沉淀。且在不同比例下形成不同的聚集类型且外观颜色不同。

图  2  三种类胡萝卜素与不同比例的水与有机相混合的样品图

注：A与D、B与E、C与F分别为虾青素、叶黄素和β-胡萝卜素；A、B、C为水入有机的滴加方式，D、E、F为有机入水的滴加方式。

Figure  2.  Samples of three carotenoids mixed with different proportions of water and organic solutions

下载: 全尺寸图片 幻灯片

通过分子间相互作用的激发，类胡萝卜素分子可在有机溶剂-水体系中自聚集形成有序的不同类型的聚集体^[25-26]。类胡萝卜素具有强疏水性，水体积分数增大，则形成更多的氢键，有利于类胡萝卜素形成卡包结构的H聚集体。相反，有机溶剂体积分数增大，有利于形成头尾结构的J聚集体^[27]。同一种类胡萝卜素样品中溶质含量相同，故颜色变化可归结于分子的堆积状态。以水入有机方式加样时，虾青素单体颜色呈橘黄色，H聚集体呈浅黄色，J聚集体粉色；叶黄素的单体呈橙黄色，H聚集体呈黄色；β-胡萝卜素单体和H聚集体均呈黄色，J聚集体呈淡粉色。并且薛长湖等^[14]发现虾青素H聚集体呈黄色、J聚集体呈粉色；Zsila等^[19]发现β-胡萝卜素的H聚集体粒子呈黄色，J聚集体粒子呈鲜红色，样品颜色由两种粒子的浓度比例决定。与本实验聚集体颜色表现一致，说明有机相的比例可以影响聚集体的形式。以有机入水的方式加样时，颜色表现与水入有机方式加样极其相似，故不赘述。

2.2   类胡萝卜素溶液紫外可见吸收

2.2.1   虾青素聚集体紫外可见光谱分析

图3为虾青素溶液在不同有机溶剂占总体积比、不同时刻下的紫外可见吸收光谱图，由图3（A）的紫外可见光谱可知，在水入有机的加样顺序下，制备的虾青素样品中有机溶剂占总体积比为60%~90%的样品在478 nm处有吸收峰，有机溶剂占总体积比为10%的样品吸收峰蓝移至389 nm处，占比为20%的样品吸收峰蓝移至390 nm处，占比为30%的样品红移，在517和560 nm处有并肩峰。Giovannetti等^[17]研究发现，将水加入到虾青素甲醇溶液中，随着含水量的增加，水溶液的紫外可见光谱由476蓝移至388 nm，是因为卡包结构的H聚集体的形成，而光谱红移至525和565 nm形成并肩峰是因为头尾结构的J聚集体的形成^[14]。因此，本实验中，有机溶剂占总体积比为60%~90%的样品为M单体，而占比为10%~20%的样品为H聚集体，占比为30%的样品为J聚集体。

图  3  不同有机占比条件下虾青素溶液的紫外可见光谱图及48 h内的光谱变化

注：A（0 h）、B（24 h）和C（48 h）为水入有机的加样顺序；D（0 h）、E（24 h）和F（48 h）为有机入水的加样顺序。

Figure  3.  UV-vis spectra of astaxanthin solutions at different organic proportions and spectral changes within 48 h

下载: 全尺寸图片 幻灯片

随着时间的变化，48 h后（图3C），形成H聚集体的10%样品最大吸收波长仅从389红移至390 nm，吸收度稍有降低，但是峰型不变，说明在48 h内，室温下，10%有机占比条件下形成的虾青素H聚集体可稳定存在。而20%的有机占比条件下形成的H聚集体在经过24 h后（图3B），最大吸收波长从390移动至478 nm，说明该条件下形成的H聚集体不能稳定存在。而有机占比为30%条件下形成的J聚集体峰型不变，可在48 h内稳定存在。

由图3（D）的紫外可见光谱可知，在有机入水的加样顺序下，制备的虾青素样品中，有机溶剂占总体积比为70%~90%的样品在478 nm处有吸收峰，而10%和20%的样品吸收峰分别蓝移至388和408 nm处，有机溶剂占总体积比为30%样品在513和557 nm处有并肩峰，占比为40%的样品在522和567 nm处有并肩峰。薛长湖等^[14]按照1:5~1:10的有机相和水相体积比将任意浓度的虾青素乙醇溶液加入壳聚糖溶液中，转速200~500 r/min下搅拌30 min以上得到黄色的虾青素H聚集体，在波长380~390 nm范围内有最大光吸收。将有机相水相体积比改为1:2~1:5，转速调为200~500 r/min，搅拌15~30 min得到粉紫色的J聚集体，在525和565 nm处有并肩峰。因此，有机溶剂占总体积比为70%~90%的样品为单体，占比为10%~20%的样品为H聚集体，占比为30%~40%的样品为J聚集体。

随着样品的放置，在有机占比为10%条件下形成的虾青素H聚集体在380 nm左右的峰值明显减弱，且24 h（图3E）和48 h（图3F）后，吸收峰分别右移至393和401 nm。20%条件下的H聚集体最大吸收波长蓝移至439 nm，且有形成并肩峰的趋势。而30%和40%条件下形成的J聚集体吸收峰基本不变，说明有机入水的加样顺序下虾青素H聚集体不稳定，而J聚集体可在48 h内稳定存在。虾青素在一些条件下会由H聚集体转化为J聚集体，除了通过改变水含量实现聚集体间的转化外，在虾青素水溶液中加入一定浓度的表面活性剂，虾青素聚集体类型也会改变，表面活性剂的浓度越大，越容易形成H聚集体。

2.2.2   叶黄素聚集体紫外可见光谱分析

叶黄素乙醇溶液的紫外吸收光谱图见图4，叶黄素乙醇有机溶剂占总体积比为10%~50%的样品吸收峰位于370~381 nm，且只有一个特征吸收峰，有机溶剂占总体积比为60%~90%的样品在428、450和478 nm处有特征吸收峰。根据Mantovani等^[28]的报道，叶黄素分子两端的游离羟基通过分子间氢键的形成促进了强耦合H聚集体的形成，其在纯乙醇中的溶解状态在421、446和474 nm处出现吸收峰。卢礼萍等^[29]的研究也表明在1:1体积的乙醇-水溶液中，叶黄素分子以平行的方式紧密排列，形成了H聚集体，在聚集体形式下叶黄素吸收光谱从单体最大吸收447蓝移至370 nm，产生了77 nm的蓝移，峰形变窄。根据上述文献^[29]对比参照，叶黄素乙醇有机溶剂占总体积比为10%~50%的样品形成叶黄素H聚集体，有机溶剂占总比为60%~90%的样品为叶黄素单体，从紫外可见光谱图可见叶黄素并没有形成J聚集体。对比图4中水入有机和有机入水两种加样方式的两种紫外可见吸收光谱图，发现其特征吸收峰的峰形和峰值并无明显差异。

图  4  不同有机占比条件下叶黄素溶液的紫外可见光谱图及48 h内的光谱变化

注：A（0 h）、B（24 h）和C（48 h）为水入有机的加样顺序；D（0 h）、E（24 h）和F（48 h）为有机入水的加样顺序。

Figure  4.  UV-vis spectra of lutein solutions at different organic proportions and spectral changes within 48 h

下载: 全尺寸图片 幻灯片

叶黄素乙醇溶液经过24和48 h的室温避光条件下放置，由图4可见，紫外可见光谱图中吸收峰的峰形没有变化，峰值略有降低。说明叶黄素有机溶剂-水体系中形成的聚集体能稳定存在。根据魏良淑等^[22]对叶黄素聚集体的研究发现，当水的比例增到乙醇的2倍后，溶液中的叶黄素全部聚集成H聚集结构，溶液中水分子数目大大增加，氢键有所增加，并且随着时间的推移，聚集体吸收光谱峰位和吸收强度没有变化。所以通过含水量变化可以改变叶黄素聚集状态，而仅通过含水量变化和长时间的放置，并不能实现叶黄素J聚集体的形成和转化。

2.2.3   β-胡萝卜素聚集体紫外可见光谱分析

图5（A）中，在水入有机的方式滴加的条件下，有机溶剂占总体积80%和90%时，在430、456和484 nm处出现吸收峰，曲方^[18]曾提到β-胡萝卜素的单体光谱在427、453和483 nm处形成光吸收峰，由于溶剂会对聚集产生一定的影响，故可推断占比为80%和90%时，β-胡萝卜素形成了M单体。有机溶剂占总体积为10%在439、471和507 nm处有吸收峰；有机溶剂占总体积为20%~40%在438、463和499 nm处有吸收峰；有机溶剂占总体积为50%在549 nm处有一小吸收峰，相较于M单体，各峰均出现一定程度的红移。且占比为50%时，红移程度最明显，可认为其形成了J聚集体，与曲方研究所得结果一致。当改变溶剂比时，吸收的蓝移部分应归因于H聚集体^[18]。故认为有机占总体积比为10%~40%内时，β-胡萝卜素存在H聚集体。

图  5  不同有机占比条件下β-胡萝卜素溶液的紫外可见光谱图及48 h内的光谱变化

注：A（0 h）、B（24 h）和C（48 h）为水入有机的加样顺序；D（0 h）、E（24 h）和F（48 h）为有机入水的加样顺序。

Figure  5.  UV-vis spectra of β-carotene solutions at different organic proportions and spectral changes within 48 h

下载: 全尺寸图片 幻灯片

以有机入水的方式滴加时，β-胡萝卜素样品中H聚集体形成于有机溶剂占总体积为10%~40%内，10%在414 nm处形成特征峰，20%~40%的特征峰位于435~444、468~472和509~511 nm范围处，且聚集体的各个特征吸收峰随有机占比的增加而右移。J聚集体形成于有机溶剂占总体积为50%~70%内，特征峰位于453、481和519 nm左右，且特征吸收峰处的吸光度随有机占比的增加而减小，与此占比下水入有机滴加方式的吸光度相比略高，可认为其聚集现象更明显。

β-胡萝卜素经过24和48 h室温避光条件下的放置，仅有机占比为10%形成的H聚集体类型不变，峰值略有降低，较为稳定存在。有机占比为20%~40%的H聚集体的特征峰明显减弱，并且出现J聚集体的特征吸收峰。即H聚集体逐渐转化为J聚集体。有机占比为50%~70%的吸收峰在24 h时衰减，并在48 h时消失。有机占比为80%和90%的吸收峰略有降低。由光谱变化可知，β-胡萝卜素H聚集体不稳定，随时间变化会实现从H聚集体向J聚集体的转化。

在有机入水的加样顺序下，有机占比为10%~20%的β-胡萝卜素H聚集体和有机占比为50%的β-胡萝卜素J聚集体的吸收峰降低，但聚集类型不变，较为稳定存在。有机占比为30%~40%的β-胡萝卜素最大吸收波长随时间变化发生红移，有变为J聚集体的趋势。而有机占比为60%~70%的β-胡萝卜素失去特征峰。有机占比为80%和90%的吸收峰略有降低但仍保持其单体状态。

3.   结论

本文选择3种典型的活性小分子虾青素、叶黄素和β-胡萝卜素作为类胡萝卜素代表，主要以水相和有机相的比例、加样顺序、样品初始浓度为关键因素，探究类胡萝卜素的聚集体形成及其变化规律。结果表明三种类胡萝卜素在水合有机体系中均可自发形成H聚集体或J聚集体，虾青素、叶黄素、β-胡萝卜素3种类胡萝卜素溶液形成H聚集体的有机溶剂占总体积比分别为10%~20%、10%~50%和10%~40%，此外，虾青素在30%形成J聚集体，β-胡萝卜素在50%~70%形成J聚集体，叶黄素在60%~90%时为叶黄素单体。且在有机入水的加样顺序下，样品的聚集比水入有机的加样顺序更显著且更加稳定。探究聚集体的稳定性发现，样品在室温（25 ℃）条件下放置24和48 h后，叶黄素的H聚集类型不变，虾青素、β-胡萝卜素的H聚集体逐渐转化为J聚集体；虾青素与β-胡萝卜素的J聚体则稳定存在。本研究通过分析紫外可见光谱探究3种类胡萝卜素聚集体形成的类型和条件，确定了聚集体形成的水合有机溶剂体积比例，并探究了聚集体之间的转化和稳定性，有望为类胡萝卜素及其聚集体的产业化应用提供理论依据。