Network Pharmacology Study on the Antibacterial Activity of Caffeoylquinic Acids
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摘要: 目的：基于网络药理学方法探讨咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的作用机制。方法：通过文献挖掘和数据库检索获取咖啡酰奎宁酸类化合物对应靶点、抑菌相关靶点及两者交集靶点，将交集靶点构建蛋白互作（protein-protein interaction network，PPI）网络，并进行基因本体（Gene Ontology，GO）分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）分析。结果：咖啡酰奎宁酸类化合物对应靶点483个，抑菌相关靶点805个，咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌作用靶点75个，起关键作用的为TNF、AKT1、ALB、MMP9、EGFR、MAPK8等靶点。GO功能分析及KEGG通路富集分析结果显示，咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的作用机制主要涉及应激反应、代谢过程、生物调节、多细胞生物过程、细胞讯息传递等生物过程，并通过细胞外基质组织、胶原蛋白降解、基质金属蛋白酶的激活和神经生长因子信号通路等多条通路共同发挥作用。化合物与分子靶点对接结果良好，验证了网络构建预测的准确性。结论：本研究揭示了咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌具有多靶点、多途径的特点，为其分子机制的进一步研究奠定了基础。
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关键词:
- 咖啡酰奎宁酸类化合物 /
- 网络药理学 /
- 抑菌活性 /
- 作用机制
Abstract: Objective:To explore the antibacterial mechanism of caffeoylquinic acids based on network pharmacology. Methods: Through literature mining and database search, the corresponding targets of caffeoylquinic acids, antibacterial related targets, and the common targets of them were obtained. The common targets were used to construct a protein-protein interaction (PPI) network, and perform Gene Ontology (GO) analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome (KEGG) analysis. Results: Caffeoylquinic acids correspond to 483 targets, 805 antibacterial related targets, and 75 antibacterial targets of caffeoylquinic acids, and the key targets were TNF、AKT1、ALB、MMP9、EGFR and MAPK8. GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis results showed that the antibacterial mechanism of caffeoylquinic acids mainly involves biological processes such as response to stimulus, metabolic processes, biological regulation, multicellular biological processes, cell communication, and work together through pathways such as extracellular matrix organization, collagen degradation, activation of matrix metalloproteinases and nerve growth factor signalling. The results of molecular docking verification between compounds and molecular targets were good, which verified the accuracy of the prediction of network construction. Conclusion: This study reveals that the antibacterial activity of caffeoylquinic acids has the characteristics of multiple targets and multiple pathways, which lays the foundation for further research on its molecular mechanism. -
细菌感染是由皮肤或体内有害细菌菌株的繁殖引起的，可引起肺炎、脑膜炎、皮肤感染、呼吸道感染以及食物中毒等问题[1]。常见的金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌等是导致人类严重感染的常见细菌[2]。细菌不断地对抗菌药物表现出抗性使抗生素的运用面临着挑战，因此从天然产物中寻找具有抗菌活性的化合物，对开发新型抑菌产品具有重要意义[3]。
咖啡酰奎宁酸类化合物是植物体内重要的次生代谢产物[4]，广泛存在于中草药及蔬菜水果中[5]，具有抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性[6-7]。研究表明，咖啡酰奎宁酸类化合物具有广谱抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、肺炎链球菌等多种致病细菌和真菌均有良好的抑制和杀灭作用[8-14]，具有开发成新型抑菌药物的潜力。但目前咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的作用靶点和作用机制尚不清楚，这在一定程度上限制了其进一步推广与应用。
网络药理学作为一门新兴学科，将药理学、生物信息学、计算机科学等多门学科相结合，可以揭示“活性成分-基因-靶点-疾病”之间复杂的网络关系，探索药物与疾病相关性，从系统水平上研究药物作用机制与规律，其系统性、整体性符合中药多组分、多靶点协同作用的特点，被广泛应用于医学、药学等领域[15-17]。分子对接是依据酶的锁-钥匙原理，从已知结构的化合物及蛋白出发，通过计算机模拟、化学计量学计算，识别并预测受体-配体结合的方法，预测蛋白质复合物结构和结合位点[18-19]。目前已有研究采用网络药理学方法来探究某些中药成分的抑菌作用机制[20-22]，但关于咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌作用的研究还较为缺乏。为深入探讨咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的作用机制，本研究基于网络药理学方法，借助中药系统药理学数据库和分析平台，预测咖啡酰奎宁酸类化合物对应靶点与抑菌作用机制，并通过分子对接进行验证，以揭示咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的科学内涵，为抑菌药物的研发提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 咖啡酰奎宁酸类化合物信息
38种咖啡酰奎宁酸类化合物网络靶点分析顺序如下：1-O-咖啡酰奎宁酸（C1）、3-O-咖啡酰奎宁酸（C2）、4-O-咖啡酰奎宁酸（C3）、5-O-咖啡酰奎宁酸（C4）、3-O-咖啡酰奎宁酸甲酯（C5）、3-O-咖啡酰奎宁酸乙酯（C6）、3-O-咖啡酰奎宁酸丁酯（C7）、4-O-咖啡酰奎宁酸甲酯（C8）、4-O-咖啡酰奎宁酸丁酯（C9）、5-O-咖啡酰奎宁酸甲酯（C10）、5-O-咖啡酰奎宁酸丁酯（C11）、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸（C12）、1,4-O-二咖啡酰奎宁酸（C13）、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸（C14）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸（异绿原酸A）（C15）、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸（异绿原酸B）（C16）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸（异绿原酸C）（C17）、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯（C18）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯（C19）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯（C20）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸乙酯（C21）、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸丁酯（C22）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸丁酯（C23）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸异丁酯（C24）、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸乙酯（C25）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-苹果酰）-奎宁酸（C26）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-苹果酸甲酯）-奎宁酸（C27）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-丙二酰）-奎宁酸（C28）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-琥珀酰奎宁酸（C29）、1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酰奎宁酸（C30）、1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酸甲酯奎宁酸（C31）、1,4-O-二咖啡酰-3-O-琥珀酰甲酯奎宁酸（C32）、1,3-O-二咖啡酰-4-O-苹果酰奎宁酸（C33）、1,3,5-O-三咖啡酰奎宁酸（C34）、1,4,5-O-三咖啡酰奎宁酸（C35）、3,4,5-O-三咖啡酰奎宁酸（C36）、3,4,5-O-三咖啡酰奎宁酸甲酯（C37）、1,3,4,5-O-四咖啡酰奎宁酸（C38）。咖啡酰奎宁酸类化合物的特征结构如图1所示。
1.2 咖啡酰奎宁酸类化合物对应靶点预测
采用Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及ChemDraw Ultra 8.0.3软件获取咖啡酰奎宁酸类化合物的SMILES结构，并将化合物的SMILES结构导入SwissTargetPrediction在线靶点筛选平台（http://www.Swisstargetprediction.ch/），获取化合物的预测靶点信息。
1.3 抑菌相关靶点的检索
以“抑菌”（antibiosis）为关键词，通过Ctd（http://ctdbase.org/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）及Genecards（https://www.genecards.org/）等数据库搜索与抑菌相关的作用靶点，去除重复靶点后得到抑菌相关靶点。
1.4 蛋白互作网络（PPI）的构建
将“1.1”所得咖啡酰奎宁酸类化合物对应靶点与“1.2”所得抑菌相关靶点进行交集，得到交集靶点，获取咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的作用靶点。将交集靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/）获得相互作用关系，构建PPI网络[23]，节点表示靶点蛋白，边表示各节点间的相互作用关系。将得到的PPI网络信息保存为TSV文件，并将该文件数据导入网络拓扑属性分析软件（Cytoscape）[24]，计算节点的度值，基于度值反映节点在网络中的重要程度，由此识别关键的靶点[25]。其中Degree值排名前30位靶点的信息如表1所示。
表 1 Degree值排名前30位靶点信息表Table 1. Information table of the top 30 targets with Degree value编号 目标基因 目标蛋白质 Degree 靶向蛋白的生物学活性 参考文献 1 TNF Tumor necrosis factor 46 杀伤转化细胞和某些病毒感染的细胞 [27] 2 AKT1 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase; 45 调控细胞存活和凋亡 [29] 3 ALB Serum albumin 40 调节血液的胶体渗透压 [30] 4 MMP9 Matrix metalloproteinase-9 36 在细胞外基质的蛋白水解和白细胞迁移中起重要作用 [31] 5 EGFR Epidermal growth factor receptor 36 参与细胞功能的调节 [32] 6 MAPK8 Mitogen-activated protein kinase 8 35 调控细胞增殖、分化、迁移及凋亡 [35] 7 CASP3 Caspase-3 34 调控细胞凋亡 [36] 8 MAPK1 Mitogen-activated protein kinase 1 33 参与细胞生长、粘附、存活和分化 [35] 9 MMP2 72 kDa type IV collagenase 30 参与血管系统重塑、血管生成、组织修复、肿瘤浸润及炎症反应 [31] 10 MAPK14 Mitogen-activated protein kinase 14 27 刺激促炎性细胞因子及激活转录因子 [37] 11 ESR1 Estrogen receptor 24 转录因子 [38] 12 SIRT1 NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-1 23 调控细胞凋亡、生存及分化 [33] 13 IL-2 Interleukin-2 21 对病原微生物的防御和清除起到重要作用 [34] 14 XIAP E3 ubiquitin-protein ligase XIAP 20 调控细胞增殖、凋亡 [39] 15 MMP1 interstitial collagenase 20 降解细胞外基质 [31] 16 MCL1 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 20 调控细胞凋亡 [40] 17 PLG Plasminogen 19 参与组织重塑和肿瘤侵袭过程 [41] 18 CASP1 Caspase-1 19 参与多种炎症过程 [42] 19 ELANE Neutrophil elastase 18 参与多种炎症过程 [43] 20 AGTR1 Type-1 angiotensin II receptor 18 调控血压和液体稳态 [44] 21 MMP7 Matrilysin 17 激活胶原蛋白原酶 [31] 22 PARP1 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 16 调控细胞生长、分化 [45] 23 CXCR2 C-X-C chemokine receptor type 2 16 参与炎症反应 [46] 24 ADAM17 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 14 参与细胞粘附、融合、迁移及信号传导 [47] 25 BCL2 Apoptosis regulator Bcl-2 14 调控细胞凋亡 [48] 26 CDK4 Cyclin-dependent kinase 4 14 调控细胞周期 [49] 27 MMP8 Neutrophil collagenase 13 降解I、II、III型胶原纤维 [50] 28 CTSK Cathepsin K 13 参与细胞外基质降解 [51] 29 SELE E-selectin 13 参与免疫粘附过程 [52] 30 MAPK10 Mitogen-activated protein kinase 10 13 刺激促炎性细胞因子 [53] 1.5 基因本体（GO）功能分析及京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析
利用WebGestalt数据库（http://www.webgestalt.org/）将交集靶点基于生物学过程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cell component，CC）术语进行GO功能分析[26]。利用Cytoscape软件中的ClueGo插件对交集靶点进行KEGG通路富集分析，选取富集基因数排名前20的通路，通过omicshare数据库（http://www.omicshare.com/tools/）绘制气泡图。
1.6 分子对接
采用AutoDock Vina软件对咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌前2的靶点蛋白与绿原酸、异绿原酸A和1,3,5-O-三咖啡酰奎宁酸3个关键成分进行分子对接验证。通过RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）数据库获取靶点蛋白晶体结构，再利用AutoDock对接软件对蛋白晶体结构去水加氢、计算电荷、去除原配体，对配体分子通过Torsion Tree进行调整，运用AutoDock Vina软件计算其对接活性位点、结合能及均方根偏差（RMSD），最后运用Pymol软件将对接结果进行可视化分析。
2. 结果与分析
2.1 咖啡酰奎宁酸类化合物对应靶点预测与抑菌相关靶点检索
现已知咖啡酰奎宁酸类化合物共38个，通过预测共获得咖啡酰奎宁酸类化合物对应靶点483个。通过Cytoscape软件对上述活性化合物与预测靶点进行关系网络的绘制和分析，构建“咖啡酰奎宁酸类化合物-靶点”网络，如图2所示。通过检索Ctd、DrugBank及Genecards等数据库共获得抑菌相关靶点805个。
2.2 PPI网络的构建
由图3可知，抑菌相关靶点共805个，咖啡酰奎宁酸类化合物对应靶点共483个，将两者取交集后得到75个交集靶点，这75个交集靶点则为咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的作用靶点。将交集靶点借助STRING数据库及Cytoscape软件进行PPI网络的构建与分析，PPI网络如图4所示。此网络包括75个节点，479条相互关系，其中度值排名前30位的靶点信息如表1所示，度值越大表明该靶点在网络中的作用越大，由此推断在咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌中起关键作用的为TNF、AKT1、ALB、MMP9、EGFR、MAPK8、CASP3、MAPK1、MMP2等基因靶点。TNF为咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌最关键的靶点，它通过和细胞膜上的特异性受体结合，杀伤转化细胞和某些病毒感染的细胞，参与抗病毒、抗细菌和细胞凋亡等生物过程[27]。有研究发现，感染金黄色葡萄球菌的免疫疾病患者如果暴露于
TNF-α抑制剂，则可能继续被感染[28]。AKT1能够通过调控细胞的存活与凋亡来发挥作用[29]。ALB则可以调节血液的胶体渗透压，进而改变细菌细胞膜的通透性，使细胞内物质泄漏，从而影响细胞代谢达到抗菌效果[30]。MMPs的水平与炎症反应有关，MMP9则主要表达于细菌感染的炎症反应的中性粒细胞和巨噬细胞中[31]。EGFR为人类表皮生长因子，是细胞增殖和信号传导的受体，其通过调控细胞增殖、分裂以及血管形成等，促进癌细胞的侵袭转移[32]。SIRT1可通过影响NF-κB细胞信号通路中乙酰化的修饰调控下游基因转录，调节机体代谢和预防感染[33]。IL-2是由激活的辅助性T淋巴细胞1产生，它能活化T细胞产生细胞因子，刺激机体产生抗体，增强单核巨噬细胞系统的功能，对病原微生物进行防御和清除，从而间接发挥抑菌作用[34]。综上所述，上述靶点主要通过调控病毒感染细胞的增殖、分化、迁移及凋亡，调节细胞代谢、参与血管系统重塑、血管生成、组织修复及炎症反应以及发挥对病毒感染细胞的免疫保护等功能来发挥抑菌作用。 ![]()
图 3 咖啡酰奎宁酸类化合物与抑菌作用靶点Venn图Figure 3. Venn diagram of caffeoylquinic acids and antibacterial related targets![]()
图 4 咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的PPI网络Figure 4. PPI network of the antibacterial effect of caffeoylquinic acids2.3 GO功能分析及KEGG通路富集分析
从生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3个不同角度对交集靶点进行GO功能分析，结果如图5所示。结果表明细胞组分主要分布在细胞膜、细胞囊、细胞核、内膜系统、细胞外间隙、腔上包膜、细胞质基质、蛋白复合体、线粒体、核内体、核被膜、细胞外基质、液泡、内质网、细胞突起、高尔基体、细胞骨架、染色体和脂滴等部位。分子功能主要集中于蛋白结合、离子结合、水解酶活性、核苷酸结合、转移酶活性、核酸结合、分子转运活性、酶调节活性、脂质结合活性、转运活性、糖结合、翻译调节活性、染色质结合、抗氧化活性、电子转移活性和氧结合。生物过程主要涉及应激反应、代谢过程、生物调节、多细胞生物过程、细胞讯息传递、细胞定位、细胞成分组织、发育过程、多组织过程、细胞增殖、繁殖、生长等。
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图 5 咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌作用靶点GO分析Figure 5. GO analysis of antibacterial targets of caffeoylquinic acids对交集靶点进行KEGG通路富集分析，富集基因数排名前20的信号通路如图6所示，结果表明咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的作用机制主要涉及细胞外基质组织（Extracellular matrix organization）、细胞外基质降解（Degradation of the extracellular matrix）、胶原蛋白降解（Collagen degradation）、基质金属蛋白酶的激活（Activation of matrix metalloproteinases）、NGF信号通路（NGF signalling）等作用通路。
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图 6 咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌关键靶点KEGG通路富集分析Figure 6. KEGG pathway enrichment analysis of key antibacterial targets of caffeoylquinic acids与通路相关的基因靶点如表2所示，通路与其相关靶点之间的相互关系如图7所示。从表2可以看出，细胞外基质降解（Degradation of the extracellular matrix）主要涉及ADAM17、CASP3、CTSK、CTSL、CTSS、ELANE、FURIN、MMP1、MMP2、MMP7、MMP8、MMP9、PLG共14个基因靶点，其中ADAM17可参与细胞粘附、融合、迁移及信号传导，CASP3可调控细胞凋亡，CTSK可参与细胞外基质降解，ELANE基因能够参与多种炎症反应，MMPs基因则可以降解细胞外基质、激活胶原蛋白酶以及胶原纤维并参与血管系统重塑、血管生成、组织修复、肿瘤浸润及炎症反应，PLG则参与组织重塑和肿瘤侵袭过程。基质金属蛋白酶的激活（Activation of matrix metalloproteinases）共涉及CTSK、ELANE、FURIN、MMP1、MMP2、MMP7、MMP8、MMP9、PLG、TPSAB1共10个基因，这些靶点主要参与细胞外基质降解、多种炎症反应，并在细胞外基质的蛋白水解和白细胞迁移中起重要作用。NGF信号通路（NGF signalling）涉及ADAM17、CASP3、FURIN、IKBKB、MAPK1、MAPK14、MAPK8共7个基因；其中，CASP3是caspase级联激活下游的关键成分，是诱导细胞凋亡的蛋白酶，执行细胞凋亡过程[36]；MAPK1则参与细胞生长、粘附、存活和分化，MAPK14能够刺激促炎性细胞因子的释放及激活转录因子，MAPK8可以调控细胞增殖、分化、迁移及凋亡。综上所述，一条作用通路可涉及多个靶点，一个靶点可参与多条通路，证实了咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌是一个涉及多个靶点、多个通路的复杂过程。
表 2 KEGG通路富集分析相关基因Table 2. Related genes for KEGG pathway enrichment analysis通路名称 相关基因 P 基因数 Intrinsic Pathway for Apoptosismembrane AKT1, BCL2, CASP3, MAPK8, XIAP 1.06455E-05 5 Activation of BH3-only proteins AKT1, BCL2, MAPK8 0.001116903 3 Signaling by ERBB4 ADAM17, EGFR, ESR1 0.003400526 3 Antigen processing-Cross presentation CTSL, CTSS, HLA-A, IKBKB 0.00495417 4 Endosomal/Vacuolar pathway CTSL, CTSS, HLA-A 4.98677E-05 3 Collagen degradation ADAM17, CTSK, CTSL, ELANE, FURIN, MMP1, MMP2, MMP7, MMP8, MMP9 1.44433E-11 10 Degradation of the extracellular matrix ADAM17, CASP3, CTSK, CTSL, CTSS, ELANE, FURIN, MMP1, MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, PLG, TPSAB1 4.44466E-13 14 Extracellular matrix organization ADAM17, CASP3, CTSK, CTSL, CTSS, ELANE, FURIN, MMP1, MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, PLG, TPSAB1 1.30521E-08 14 Collagen formation CTSL, CTSS, MMP7, MMP9 0.003399094 4 Activation of Matrix Metalloproteinases CTSK, ELANE, FURIN, MMP1, MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, PLG, TPSAB1 1.04463E-14 10 Toll Like Receptor 4 (TLR4) Cascade IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 3.28081E-05 7 Activated TLR4 signalling IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 1.58446E-05 7 MyD88:Mal cascade initiated on plasma IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 4.33043E-06 7 MyD88-independent TLR4 cascade IKBKB, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 6.96357E-05 6 NGF signalling ADAM17, CASP3, FURIN, IKBKB, MAPK1, MAPK14, MAPK8 0.000194394 7 Trafficking and processing of endosomal TLR CTSK, CTSL, CTSS 8.55839E-05 3 Toll Like Receptor 9 (TLR9) Cascade IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 5.3083E-06 7 Toll Like Receptor 10 (TLR10) Cascade IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 2.08051E-06 7 Toll Like Receptor 3 (TLR3) Cascade IKBKB, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 6.58958E-05 6 Toll Like Receptor 5 (TLR5) Cascade IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 2.08051E-06 7 ![]()
图 7 咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌作用靶点与作用通路网络分析Figure 7. Caffeoylquinic acids antibacterial targets and pathway network analysis2.4 分子对接验证
为了验证咖啡酰奎宁酸类化合物预测靶点的准确性，本研究采用AutoDock Vine软件对3个关键成分和2个靶点进行分子对接，以自由结合能（binding energy）作为筛选条件，结合能越小表示对接结果越好。对于多构象的对接结果，筛选出结合能最低的对接构象，如表3所示。化合物与分子靶点对接得分均大于5.0，表明分子对接结果良好，验证了网络构建预测的准确性。运用Pymol软件，根据结合能的大小选出每个靶点蛋白对接最好的化合物进行可视化分析，结果如图8所示，其中TNF与绿原酸、异绿原酸A，AKT1与1,3,5-O-三咖啡酰奎宁酸均可以形成氢键，为进一步整合探析咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌提供理论参考。
表 3 2个靶点与3个关键成分的分子对接得分Table 3. Molecular docking scores of 2 targets and 3 key components化合物 靶点 蛋白库编号 自由结合能（ kCal/mol） 均方根误差 绿原酸 TNF 6rmj −9.6 1.205 AKT1 3o96 −9.1 1.983 异绿原酸A TNF 6rmj −9.6 0.477 AKT1 3o96 −10.1 1.729 1,3,5-O-三咖啡酰奎宁酸 TNF 6rmj −7.0 3.494 AKT1 3o96 −10.5 1.986 ![]()
图 8 TNF、AKT1与关键成分的最佳对接构象注：A. TNF与绿原酸的最佳对接构象；B. TNF与异绿原酸A的最佳对接构象；C. AKT1与 1,3,5-O-三咖啡酰奎宁酸的最佳对接构象。Figure 8. Optimal docking conformation of TNF, AKT1 and key components3. 结论
采用网络药理学的方法，借助相关数据库及软件对咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的作用靶点、作用机制及相关通路进行了探讨，结果表明咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌作用靶点为75个。PPI网络分析结果得出咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的关键靶点为TNF、AKT1、ALB、MMP9、EGFR、MAPK8、CASP3、MAPK1、MMP2等；GO功能分析结果表明咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌主要涉及细胞膜、细胞囊、细胞核、内膜系统、细胞外间隙、腔上包膜、细胞外基质等细胞组分，涉及蛋白结合、离子结合、水解膜活性、核苷酸结合、转移酶活性、核酸结合、分子转运活性等分子功能以及参与应激反应、代谢过程、生物调节、多细胞生物过程、细胞讯息传递、细胞定位、细胞成分组织等多个生物过程；KEGG通路富集分析结果表明主要涉及细胞外基质组织信号通路、细胞外基质降解信号通路、胶原蛋白降解信号通路、基质金属蛋白酶的激活信号通路、NGF信号通路等多条途径，表明咖啡酰奎宁酸类化合物能够通过多靶点、多途径发挥抑菌作用。通过分子对接验证得到关键化合物与关键靶点对接得分均大于5.0，TNF与绿原酸、异绿原酸A，AKT1与1,3,5-O-三咖啡酰奎宁酸均可以形成氢键，表明分子对接结果良好，验证了网络构建预测的准确性，可以为后期的抑菌药物研究提供理论基础和实验数据。虽然本研究预测所得到的咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌作用靶点与迄今为止的研究较为接近，表明运用网络药理学方法探讨其作用机制具有一定的参考价值，但是网络药理学是基于数据进行研究，尚不能确保结果完全准确，因此还需要研究其具体分子机制以得到更为科学准确的结果。
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图 3 咖啡酰奎宁酸类化合物与抑菌作用靶点Venn图
Figure 3. Venn diagram of caffeoylquinic acids and antibacterial related targets
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图 4 咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌的PPI网络
Figure 4. PPI network of the antibacterial effect of caffeoylquinic acids
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图 5 咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌作用靶点GO分析
Figure 5. GO analysis of antibacterial targets of caffeoylquinic acids
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图 6 咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌关键靶点KEGG通路富集分析
Figure 6. KEGG pathway enrichment analysis of key antibacterial targets of caffeoylquinic acids
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图 7 咖啡酰奎宁酸类化合物抑菌作用靶点与作用通路网络分析
Figure 7. Caffeoylquinic acids antibacterial targets and pathway network analysis
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图 8 TNF、AKT1与关键成分的最佳对接构象
注：A. TNF与绿原酸的最佳对接构象；B. TNF与异绿原酸A的最佳对接构象；C. AKT1与 1,3,5-O-三咖啡酰奎宁酸的最佳对接构象。
Figure 8. Optimal docking conformation of TNF, AKT1 and key components
表 1 Degree值排名前30位靶点信息表
Table 1 Information table of the top 30 targets with Degree value
编号 目标基因 目标蛋白质 Degree 靶向蛋白的生物学活性 参考文献 1 TNF Tumor necrosis factor 46 杀伤转化细胞和某些病毒感染的细胞 [27] 2 AKT1 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase; 45 调控细胞存活和凋亡 [29] 3 ALB Serum albumin 40 调节血液的胶体渗透压 [30] 4 MMP9 Matrix metalloproteinase-9 36 在细胞外基质的蛋白水解和白细胞迁移中起重要作用 [31] 5 EGFR Epidermal growth factor receptor 36 参与细胞功能的调节 [32] 6 MAPK8 Mitogen-activated protein kinase 8 35 调控细胞增殖、分化、迁移及凋亡 [35] 7 CASP3 Caspase-3 34 调控细胞凋亡 [36] 8 MAPK1 Mitogen-activated protein kinase 1 33 参与细胞生长、粘附、存活和分化 [35] 9 MMP2 72 kDa type IV collagenase 30 参与血管系统重塑、血管生成、组织修复、肿瘤浸润及炎症反应 [31] 10 MAPK14 Mitogen-activated protein kinase 14 27 刺激促炎性细胞因子及激活转录因子 [37] 11 ESR1 Estrogen receptor 24 转录因子 [38] 12 SIRT1 NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-1 23 调控细胞凋亡、生存及分化 [33] 13 IL-2 Interleukin-2 21 对病原微生物的防御和清除起到重要作用 [34] 14 XIAP E3 ubiquitin-protein ligase XIAP 20 调控细胞增殖、凋亡 [39] 15 MMP1 interstitial collagenase 20 降解细胞外基质 [31] 16 MCL1 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 20 调控细胞凋亡 [40] 17 PLG Plasminogen 19 参与组织重塑和肿瘤侵袭过程 [41] 18 CASP1 Caspase-1 19 参与多种炎症过程 [42] 19 ELANE Neutrophil elastase 18 参与多种炎症过程 [43] 20 AGTR1 Type-1 angiotensin II receptor 18 调控血压和液体稳态 [44] 21 MMP7 Matrilysin 17 激活胶原蛋白原酶 [31] 22 PARP1 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 16 调控细胞生长、分化 [45] 23 CXCR2 C-X-C chemokine receptor type 2 16 参与炎症反应 [46] 24 ADAM17 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 14 参与细胞粘附、融合、迁移及信号传导 [47] 25 BCL2 Apoptosis regulator Bcl-2 14 调控细胞凋亡 [48] 26 CDK4 Cyclin-dependent kinase 4 14 调控细胞周期 [49] 27 MMP8 Neutrophil collagenase 13 降解I、II、III型胶原纤维 [50] 28 CTSK Cathepsin K 13 参与细胞外基质降解 [51] 29 SELE E-selectin 13 参与免疫粘附过程 [52] 30 MAPK10 Mitogen-activated protein kinase 10 13 刺激促炎性细胞因子 [53] 
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表 2 KEGG通路富集分析相关基因
Table 2 Related genes for KEGG pathway enrichment analysis
通路名称 相关基因 P 基因数 Intrinsic Pathway for Apoptosismembrane AKT1, BCL2, CASP3, MAPK8, XIAP 1.06455E-05 5 Activation of BH3-only proteins AKT1, BCL2, MAPK8 0.001116903 3 Signaling by ERBB4 ADAM17, EGFR, ESR1 0.003400526 3 Antigen processing-Cross presentation CTSL, CTSS, HLA-A, IKBKB 0.00495417 4 Endosomal/Vacuolar pathway CTSL, CTSS, HLA-A 4.98677E-05 3 Collagen degradation ADAM17, CTSK, CTSL, ELANE, FURIN, MMP1, MMP2, MMP7, MMP8, MMP9 1.44433E-11 10 Degradation of the extracellular matrix ADAM17, CASP3, CTSK, CTSL, CTSS, ELANE, FURIN, MMP1, MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, PLG, TPSAB1 4.44466E-13 14 Extracellular matrix organization ADAM17, CASP3, CTSK, CTSL, CTSS, ELANE, FURIN, MMP1, MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, PLG, TPSAB1 1.30521E-08 14 Collagen formation CTSL, CTSS, MMP7, MMP9 0.003399094 4 Activation of Matrix Metalloproteinases CTSK, ELANE, FURIN, MMP1, MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, PLG, TPSAB1 1.04463E-14 10 Toll Like Receptor 4 (TLR4) Cascade IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 3.28081E-05 7 Activated TLR4 signalling IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 1.58446E-05 7 MyD88:Mal cascade initiated on plasma IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 4.33043E-06 7 MyD88-independent TLR4 cascade IKBKB, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 6.96357E-05 6 NGF signalling ADAM17, CASP3, FURIN, IKBKB, MAPK1, MAPK14, MAPK8 0.000194394 7 Trafficking and processing of endosomal TLR CTSK, CTSL, CTSS 8.55839E-05 3 Toll Like Receptor 9 (TLR9) Cascade IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 5.3083E-06 7 Toll Like Receptor 10 (TLR10) Cascade IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 2.08051E-06 7 Toll Like Receptor 3 (TLR3) Cascade IKBKB, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 6.58958E-05 6 Toll Like Receptor 5 (TLR5) Cascade IKBKB, IRAK4, MAP3K7, MAPK1, MAPK10, MAPK14, MAPK8 2.08051E-06 7
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表 3 2个靶点与3个关键成分的分子对接得分
Table 3 Molecular docking scores of 2 targets and 3 key components
化合物 靶点 蛋白库编号 自由结合能（ kCal/mol） 均方根误差 绿原酸 TNF 6rmj −9.6 1.205 AKT1 3o96 −9.1 1.983 异绿原酸A TNF 6rmj −9.6 0.477 AKT1 3o96 −10.1 1.729 1,3,5-O-三咖啡酰奎宁酸 TNF 6rmj −7.0 3.494 AKT1 3o96 −10.5 1.986
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