Effect of Microbial Fermentation Technology on Chemical Constituents of Pueraria thomsonii
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摘要: 目的：利用微生物发酵技术提高粉葛中活性成分的含量，以扩大其功能性产品的研究。方法：首先以粉葛饮片为原料，嗜酸乳杆菌为发酵菌种，葛根素含量为指标，接种量、料液比、发酵时间、发酵温度为影响因素，通过单因素结合响应面设计法优化粉葛的发酵工艺。其次，通过高效液相色谱法、紫外分光光度法、双波长法测定发酵前、后粉葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元、总异黄酮、可溶性多糖及总淀粉的含量。结果：粉葛最优发酵条件为：接种量5%，料液比1:3 g/mL，发酵时间36 h，发酵温度29 ℃，葛根素实际含量为8.1854 mg/g与预测值8.2092 mg/g相比，相对误差仅为0.29%。发酵后粉葛中葛根素、大豆苷、大豆苷元、总异黄酮、可溶性多糖、支链淀粉含量均增加，直链淀粉和总淀粉含量减少，与发酵前相比差异均具有显著性（P<0.05）。结论：结果表明微生物发酵技术能够提升粉葛中活性成分的含量。Abstract: Objective: In order to expand the research of functional products, the content of active ingredients in Pueraria thomsonii was increased by microbial fermentation technology. Methods: Firstly, the fermentation process of Pueraria thomsonii was optimized by the combination of single factor test and response surface methodology with the decoction pieces of Pueraria thomsonii as raw material, L. acidophilus as fermentation strain, puerarin content as index, and inoculation amount, solid-liquid ratio, fermentation time and fermentation temperature as acting factors. Secondly, the contents of puerarin, daidzin, daidzein, total isoflavones, soluble polysaccharides and total starch in Pueraria thomsonii were determined by high performance liquid chromatography, ultraviolet spectrophotometry and dual wavelength method before and after fermentation. Results: The optimal fermentation conditions were as follows: Inoculation amount 5%, solid-liquid ratio 1:3 g/mL, fermentation time 36 h, fermentation temperature 29 ℃. The relative error was 0.29% between the actual content 8.1854 mg/g and predicted value 8.2092 mg/g of puerarin. After fermentation, the contents of puerarin, daidzin, daidzein, total isoflavones, soluble polysaccharides and amylopectin in Pueraria thomsonii increased, while the contents of amylose and total starch decreased, showing significant differences compared with those before fermentation (P<0.05). Conclusion: The results showed that microbial fermentation technology could improve the content of active ingredients in Pueraria thomsonii.
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粉葛为豆科植物甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥块根，具有营养独特、药食兼优的特点，是国家卫生健康委员会收纳的药食同源类中药[1-2]。粉葛具有抗心肌缺血、降血糖、降血脂、解热、抗病毒等多种药理作用，其发挥药效的主要成分是异黄酮类化合物，如葛根素[3-6]。粉葛早期因与野葛在功效、主治上皆相同，故统称作葛根。但随着研究的不断深入，粉葛被证明在植物形态、成分种类及含量上均与野葛存在较大差异，如葛根素的含量是葛根的1/8[6-8]。因此，2005版中华人民共和国药典将粉葛与野葛以来源进行区分，形成粉葛多食用、野葛多药用的现状[9]。
微生物发酵是一种传统的中药炮制方法，能够对中药的性味功效、化学成分及药理作用产生影响，具有改变中药原有性能、增强或产生新的功效、降低毒性等作用[10-11]。经微生物发酵炮制的中药种类繁多，广泛用于多种疾病的治疗。Cao等[12]通过发酵方法降低剧毒类生物碱类化合物的含量以生产华丰丹药木；张红艳等[13]将中药复方经微生物发酵后，其活性成分得到增加；Wang等[14]利用鼠李糖乳杆菌217-1发酵使得葛根中葛根素和异黄酮的含量均得到增加；陈艳艳[15]利用酿酒酵母固体粉末发酵葛根，使葛根黄酮的含量升高41.2%。
目前微生物发酵技术已广泛应用于各研究领域中，但尚未见粉葛微生物发酵相关文章的报道。因此，本实验选用碳水化合物代谢作用较强的嗜酸乳杆菌为发酵菌种，首次对淀粉含量颇高的药食同源中药粉葛进行微生物发酵研究。借助响应曲面设计法优化粉葛的发酵工艺，并对其发酵前后主要成分进行含量测定和比较，以探讨微生物发酵技术对粉葛中活性成分的作用。进一步分析微生物发酵技术用于增加粉葛活性成分的可行性，为粉葛资源的充分利用提供理论依据和实践基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
粉葛 购自山西国泰中药股份有限公司，粉碎，过40目筛，备用；嗜酸乳杆菌 保藏于山西中医药大学食品工艺发酵实验室，经液态培养基培养后，总活菌数为3×107 CFU/mL的菌液，于4 ℃冰箱中保藏，备用；葛根素标准品 成都格利普生物科技有限公司，批号18082401；大豆苷元标准品（批号5160）、大豆苷标准品（批号5901） 购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；直链淀粉标准品 北京北方伟业计量技术研究院，批号20210910；支链淀粉标准品（批号A01N11L129489）、葡萄糖标准品（批号S22J12H137237） 购自上海源叶生物有限公司；色谱级甲醇（批号204135）、乙腈（批号201343） 购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；牛肉膏、蛋白胨 购自北京奥博星生物技术有限责任公司；其余试剂均国产分析纯。
BSP-250生化培养箱、YXQ-LS-75SII立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2F双人双面净化工作台 上海书培实验设备有限公司；L-3000高效液相色谱仪、Ultra-3660紫外分光光度计 北京普源精电科技有限公司；BSA-224S-CW电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司；SZF-06C脂肪测定仪 济南精密科学仪器仪表有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 粉葛发酵工艺流程及操作要点
粉葛饮片→粉碎→过筛（40目）→加超纯水→高压灭菌→接入嗜酸乳杆菌菌液→静置发酵→干燥（70℃）→粉葛发酵品
操作要点：菌液制备：按牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，水1000 mL配制液体培养基，121 ℃高压灭菌20 min，冷却，无菌条件下接入已活化的嗜酸乳杆菌，37 ℃，150 r/min培养24 h，即得嗜酸乳杆菌菌液，计数得总活菌数为3×107 CFU/mL。
粉碎、过筛：将药材全部粉碎过筛，40目，以增加代表性。
接菌：在无菌条件下按比例接入嗜酸乳杆菌菌液，摇匀。
1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 接种量对葛根素含量的影响
固定料（粉葛粉末）液（蒸馏水）比1:4 g/mL，发酵温度31 ℃，发酵时间36 h，以葛根素含量为指标，考察不同接种量（4%、6%、8%、10%、12%）对发酵的影响。
1.2.2.2 料液比对葛根素含量的影响
固定接种量8%，温度31 ℃，时间36 h，以葛根素含量为指标，考察不同料液比（1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 g/mL）对发酵的影响。
1.2.2.3 发酵温度对葛根素含量的影响
固定接种量8%，料液比1:4 g/mL，时间36 h，以葛根素含量为指标，考察不同发酵温度（27、29、31、33、35 ℃）对发酵的影响。
1.2.2.4 发酵时间对葛根素含量的影响
固定接种量8%，料液比1:4 g/mL，温度31 ℃，以葛根素含量为指标，考察不同发酵时间（12、24、36、48、60 h）对发酵的影响。
1.2.3 响应曲面试验设计
在单因素实验的基础上，以Box-Behnken为原理，葛根素含量为响应值，接种量、料液比、发酵时间为影响因素，进行三因素三水平的响应曲面设计，因素及水平见表1。
表 1 响应面因素和水平设计Table 1. Response surface factor and level design水平 因素 A接种量（%） B料液比（g/mL） C发酵时间（h） −1 4 1:2 24 0 6 1:3 36 1 8 1:4 48 1.2.4 粉葛发酵前后水分、灰分测定
水分含量测定参照GB 5009.3-2016食品中水分的测定；灰分含量测定参照GB 5009.4-2016食品中灰分的测定。
1.2.5 粉葛发酵前后葛根素、大豆苷元、大豆苷含量测定
1.2.5.1 色谱条件
Compass C18（2）（250×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0~30 min，24% A；30~60 min，60% A）。检测波长250 nm，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测时间60 min[16]。
1.2.5.2 标准溶液制备及标准曲线绘制
精密称取葛根素、大豆苷、大豆苷元标准品适量，50%乙醇溶解，得0.2 mg/mL大豆苷、大豆苷元标准溶液，0.4 mg/mL葛根素标准溶液。精密移取各标准溶液稀释制得系列标准工作液，0.45 μm微孔滤器过滤，参照1.2.5.1色谱条件。分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得葛根素线性回归方程：y=31848x−129.83（R2=0.9992），大豆苷元线性回归方程：y=49.71x−49.798（R2=0.9994），大豆苷线性回归方程：y=32.096x−149.36（R2=0.9993），表明葛根素在0.1~0.22 mg/mL、大豆苷元在4~64 μg/mL、大豆苷在8~80 μg/mL范围内线性关系均良好。
1.2.5.3 供试品溶液制备
精密称取样品粉末0.5 g（40目），加20 mL 50%乙醇，称重，70 ℃加热提取50 min，冷却，称重，补足减失重量，摇匀，过滤，0.45 μm微孔滤器过滤，即得供试品溶液。
1.2.6 总异黄酮含量测定
1.2.6.1 标准溶液制备及标准曲线绘制
葛根素标准溶液制备同1.2.5.2，稀释得系列标准工作液。以50%乙醇为空白溶液，250 nm处测定吸光度[17]。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得线性回归方程：y=0.0382x+0.1101（R2=0.9995），表明葛根素在2~20 μg/mL范围内线性关系良好。
1.2.6.2 供试品溶液制备
供试品溶液制备同1.2.5.3。
1.2.7 可溶性多糖含量测定
1.2.7.1 葡萄糖标准溶液制备及标准曲线绘制
精密称取适量葡萄糖标准品，以水配制0.5 g/mL标准溶液，稀释得系列标准工作液。采用苯酚-浓硫酸法显色[18]，于490 nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得线性回归方程：y=0.0376x+0.0948（R2=0.9992），表明葡萄糖在2.5~15 μg/mL范围内线性关系良好。
1.2.7.2 供试品溶液制备
精密称取样品粉末各2.0 g，加80 mL水，80 ℃超声提取30 min，共两次，过滤，合并滤液，浓缩，按体积1:3加95%乙醇，低温静置24 h，离心，沉淀加水复溶，过滤，50 mL容量瓶定容，即得供试品溶液。
1.2.8 总淀粉含量测定
1.2.8.1 标准溶液制备
分别精密称取直链、支链淀粉标准品适量，10 mL 1 mol/L氢氧化钾溶液沸水浴溶解，冷却，超纯水定容，得1 mg/mL标准溶液。
1.2.8.2 选择测定波长和参比波长
精密移取2 mL直链淀粉标准溶液、5 mL支链淀粉标准溶液分别于50 mL容量瓶中，参照崔晋和赵璇等[19-20]方法测定直链和支淀粉吸收曲线。根据等吸收点作图法，确定直链淀粉的测定波长和参照波长；支链淀粉的测定波长和参照波长。
1.2.8.3 标准曲线绘制
参照1.2.8.2稀释各标准溶液得各系列标准工作液，以超纯水为空白溶液，于λ1和λ2测定直链淀粉吸光度值A1和A2；λ3和λ4测定支链淀粉吸光度值A3和A4。以直链淀粉浓度为横坐标，A1-A2为纵坐标，得线性回归方程为：y=0.0061x−0.0779（R2=0.9992），表明直链淀粉在60~120 μg/mL范围内线性关系良好。以支链淀粉浓度为横坐标，A3-A4为纵坐标，得线性回归方程为：y=0.0018x+0.0458（R2=0.999），表明支链淀粉在80~140 μg/mL范围内线性关系良好。
1.2.8.4 供试品溶液制备
精密称取样品粉末各3.0 g，干燥至恒重，计算含水量W1。干燥后的样品，以80 mL石油醚为溶剂，加热回流4 h，以85%乙醇为溶剂，继续回流4 h，干燥至恒重，计算糖脂比W2。精密称取脱脂脱糖样品0.1 g，参照1.2.8.1制备供试品溶液。
1.3 数据处理
利用SPSS 26.0分析数据，Graphpad prism v6.01作图。Design-Expert.V8.0.6进行响应曲面设计及绘图。每组实验重复三次，结果以平均值加减标准差（
2. 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 接种量对葛根素含量的影响
接种量与发酵基质中菌种的繁殖速度密切相关，适宜接种量不仅可以缩短发酵时间，提高发酵速率，而且对于发酵基质的状态及营养物质含量存在调控作用[21]。如图1所示，随着接种量的增大，葛根素含量先上升后下降，于6%时达到最大值，为5.75 mg/g。当其他因素固定时，菌种接入比例增大，会使发酵基质中营养物质含量减少。当接种量大于6%时，发酵基质中营养物质匮乏，菌株之间接触抑制增强，不利于葛根素生成[15]。对数据进行显著性分析，与其他组相比，当接种量为6%时，葛根素含量变化具有显著性（P<0.05）。因此，选择最适接种量为6%。
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2.1.2 料液比对葛根素含量的影响
料液比会对发酵底物浓度产生影响，进而影响发酵效率[22]。如图2所示，随着料液比的增大，葛根素的含量先上升后下降，于1:3 g/mL时达到最大值，为5.38 mg/g。水量增加能促进营养物质溶出，有助于菌种生长繁殖。但水量持续增加会稀释营养物质，不利于菌种吸收利用，减慢代谢产物积累。对数据进行显著性分析，与其他组相比，当料液比为1:3 g/mL时，葛根素含量变化具有显著性（P<0.05）。因此，选择最适料液比为1:3 g/mL。
2.1.3 发酵温度对葛根素含量的影响
发酵温度对菌种的活性具有不同程度的影响作用。温度偏高或偏低均不利于菌种生长[23]。如图3所示，随着温度的升高，葛根素含量先上升后下降，29 ℃时达到最大值（为5.51 mg/g），与宋艳秋等[24]微生物转化葛根素的温度（28 ℃）相接近。对数据进行显著性分析，与31 ℃、33 ℃发酵条件相比，当发酵温度为29 ℃时，葛根素含量变化不具有显著性（P˃0.05）。因此，固定发酵粉葛的最适温度为29 ℃，响应曲面设计中不做考察。
2.1.4 发酵时间对葛根素含量的影响
发酵时间对葛根素含量的影响如图4所示。在12~36 h发酵时间内，葛根素含量呈现上升趋势，且于36 h时达到最大值，为5.78 mg/g。之后随发酵时间延长，发酵基质中有限的营养物质可能限制菌种生长和代谢，不利于葛根素生成，使葛根素含量下降。对数据进行显著性分析，与其他组相比，当发酵时间为36 h时，葛根素含量变化具有显著性（P<0.05）。因此，选择最适发酵时间为36 h，与倪以宇等[25]利用混合乳酸菌发酵葛根-枳椇子药对的时间相一致。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 回归模型及方差分析
通过对响应面试验结果（表2）进行方差分析及回归模型预测，得葛根素的含量（y）与接菌量（A）、料液比（B）、发酵时间（C）的二次回归模型：
表 2 响应面设计及结果Table 2. Response surface design and result试验号 A接种量 B料液比 C发酵时间 含量（mg/g） 1 0 1 1 6.21 2 1 1 0 5.85 3 1 0 1 5.64 4 1 −1 0 6.41 5 0 −1 1 7.00 6 0 0 0 8.04 7 0 0 0 7.78 8 1 0 −1 6.57 9 −1 0 1 7.59 10 0 1 −1 6.04 11 0 −1 −1 6.10 12 −1 −1 0 5.90 13 0 0 0 8.40 14 −1 1 0 7.44 15 0 0 0 8.26 16 −1 0 −1 7.91 17 0 0 0 7.71 y=8.04−0.58×A+0.05×B−0.023×C−0.46×AB−0.15×AC−0.18×BC−0.56×A2−1.15×B2−0.55×C2
如表3所示，模型P=0.0250，<0.05，差异显著，失拟项P=0.0528，>0.05，差异不显著性，模型相关系数R2=0.8612，均表明模型可靠，与实际情况拟合度良好，可以用来描述各因素与葛根素含量之间的关系。各因素对葛根素含量的影响顺序：A>B>C，即接种量>料液比>发酵时间，其中接种量对葛根素含量的影响作用具有显著性（P<0.05）。
表 3 回归模型方差分析表Table 3. Regression model variance analysis table方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 12.71 9 1.41 4.83 0.0250 显著 A 2.69 1 2.69 9.19 0.0191 显著 B 0.020 1 0.020 0.068 0.8013 C 4.050×10−3 1 4.050×10−3 0.014 0.9097 AB 0.84 1 0.84 2.86 0.1346 AC 0.093 1 0.093 0.32 0.5905 BC 0.13 1 0.13 0.46 0.5216 A2 1.31 1 1.31 4.47 0.0722 B2 5.55 1 5.55 18.95 0.0033 显著 C2 1.29 1 1.29 4.39 0.0743 残差 2.05 7 0.29 失拟项 1.69 3 0.56 6.37 0.0528 不显著 纯误差 0.35 4 0.089 总离差 14.76 16 注：P<0.05表示具有显著性，P˃0.05表示不具有显著性。 2.2.2 响应曲面图和等高线图
为进一步确定接种量、料液比、发酵时间对葛根素含量的影响，固定其中任一因素的水平为零，通过回归方程分析，得另外两因素交互作用的响应曲面图及等高线图[26]。响应曲面坡度越陡，等高线越趋于椭圆形、密度越大，说明两个因素的交互作用越明显[20]。如图5所示，接种量与料液比、发酵时间与接种量、料液比与发酵时间之间对葛根素含量均存在一定交互作用，且葛根素含量在各因素的水平范围内均存在最大值。但等高线图密度均不大，影响不具显著性（P<0.05）[27]。
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图 5 接种量、料液比、发酵时间对葛根素含量的响应曲面图及等高线图Figure 5. Response surface and contour plots of inoculation amount, solid-liquid ratio and fermentation time on puerarin content2.2.3 优化及验证
粉葛发酵的最优工艺：接种量4.84%（V/V），料液比1:3.14 g/mL，发酵时间36.44 h，葛根素含量的预测值为8.2092 mg/g。为方便实验室操作，将发酵条件调整为：接种量5%，料液比1:3 g/mL，发酵时间为36 h。在此条件下进行三次平行验证试验，得到葛根素含量为8.1854±0.02 mg/g，与预测值的相对误差仅为0.29%，表明优化结果稳定可靠，可行性高。如图6所示，同等条件下，发酵后粉葛颜色较发酵前深，颗粒感明显。
2.3 成品主要指标测定结果
2.3.1 水分、灰分
2020版《中国药典》中规定粉葛及其炮制品的水分含量不得超过12.0%，灰分含量不得超过5.0%。如表4所示，发酵前、后粉葛中水分和灰分的含量均符合规定。
表 4 发酵前、后粉葛中水分、灰分测定结果（n=3）Table 4. Determination results of moisture and ash in Pueraria thomsonii before and after fermentation (n=3)测定项 水分（%） 灰分（%） 发酵前粉葛 9.69±0.01 3.89±0.05 发酵后粉葛 8.19±0.08 4.19±0.03 2.3.2 葛根素、大豆苷、大豆苷元
如图7色谱图和表5所示，与发酵前粉葛相比，发酵后粉葛中大豆苷元、大豆苷、葛根素含量均增加，且分别为发酵前粉葛的1.727倍、1.726倍、1.685倍，差异均具有显著性（P<0.05）。葛根素的增加倍数与杜静等[28]利用冠突散囊菌双向发酵葛根之结果（1.6倍）接近。其中大豆苷元的含量增加较多，可能是因为大豆苷元属于异黄酮苷元，在发酵过程中优先生成，异黄酮苷（大豆苷、葛根素）后生成。大豆苷的生成量大于葛根素，可能是因为葡萄糖与苯环上的羟基脱水缩合的作用大于苯环上的氢键[29-30]。
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图 7 发酵前、后粉葛中异黄酮类成分HPLC图注：A.混合标准品；B.发酵前粉葛样品；C.发酵后粉葛样品；1.葛根素；2.大豆苷；3.大豆苷元。Figure 7. HPLC diagrams of isoflavones in Puerariae thomsonii before and after fermentation表 5 发酵前、后粉葛中异黄酮类成分含量测定结果（n=3）Table 5. Determination results of isoflavone content in Puerariae thomsonii before and after fermentation (n=3)测定项 测定成分（mg/g） 大豆苷元 大豆苷 葛根素 总异黄酮 发酵前粉葛 0.22±0.02 0.84±0.02 4.85±0.06 25.68±0.15 发酵后粉葛 0.38±0.02* 1.45±0.03** 8.17±0.02** 33.26±0.34** 注：*表示P<0.05，**表示P<0.01；表6同。 2.3.3 总异黄酮
如表5所示，与发酵前粉葛相比，发酵后粉葛中总异黄酮含量增至33.26 mg/g，是发酵前粉葛的1.295倍，差异具有显著性（P<0.01）。这与倪以宇等[25]利用植物乳杆菌和副干酪乳杆菌混合发酵葛根-枳椇子药对时异黄酮含量显著增多之结果相一致。
2.3.4 可溶性多糖
如表6所示，与发酵前相比，发酵后粉葛中可溶性多糖含量增至12.6%，是发酵前粉葛的5.101倍，差异具有显著性（P<0.01），与柴小涛[31]利用食药性真菌-金耳双向发酵葛根得葛根多糖含量下降之结果相反。可能是因为乳酸杆菌是一类碳水化合物代谢作用较强的益生菌，在发酵过程中以淀粉为碳源，代谢产生游离葡萄糖或小分子葡萄糖聚合物，增加了可溶性多糖的含量[32-33]。
表 6 粉葛发酵前、后可溶性多糖及淀粉含量测定结果（n=3）Table 6. Determination results of soluble polysaccharides and starch contents in Puerariae thomsonii before and after fermentation (n=3)测定项 可溶性多糖（%） 淀粉（%） 直链淀粉 支链淀粉 总淀粉 发酵前粉葛 2.47±0.05 8.28±0.07 − 8.28±0.07 发酵后粉葛 12.6±0.06** 6.44±0.11** 0.98±0.04 7.42±0.07** 注：−表示未检出。 2.3.5 总淀粉
如图8所示，直链淀粉的测定波长λ1=600 nm，参照波长λ2=422 nm；支链淀粉的测定波长λ3=536 nm，参照波长λ4=700 nm。测得结果如表6所示，与发酵前相比发酵后粉葛中直链淀粉和总淀粉含量均减少，减至6.44%、7.42%，分别减少至0.778倍、0.896倍，差异具有显著性（P<0.01）。发酵前粉葛中支链淀粉的含量可能受到高含量直链淀粉影响而不利于检出[34]，推测其含量可能未达到团体标准T/GXAS 222-2021中检出限（0.1 g/100 g）。发酵后粉葛中支链淀粉的含量增至0.98%，可能是直链淀粉在嗜酸乳杆菌的作用下转化为支链淀粉，使其含量增加。通过数据分析发现，总淀粉含量与可溶性多糖含量呈现负相关，此结论与岳世彦等[35]和张应等[36]的研究结果相一致。
3. 结论
通过微生物发酵技术可提高粉葛中活性成分含量，发酵最优工艺为：接种量5%，料液比1:3 g/mL，发酵时间36 h，发酵温度29 ℃。在此发酵条件下所得粉葛中大豆苷元、大豆苷、葛根素、总异黄酮、可溶性多糖、总淀粉含量分别为0.38 mg/g、1.45 mg/g、8.17 mg/g、33.26 mg/g、12.6%、7.42%，是发酵前（0.22 mg/g、0.84 mg/g、4.85 mg/g、25.68 mg/g、2.47%、8.28% ）的1.727、1.726、1.685、1.295、5.101、0.896倍。借助微生物发酵技术可不同程度增加粉葛中活性成分含量，这与陈艳艳[15]、宋艳秋等[24]、倪以宇等[25]发酵葛根的结果趋于一致，表明利用微生物发酵粉葛提高活性成分含量具有一定可行性。粉葛中异黄酮等活性成分含量增加，可开拓粉葛相关功能性产品及保健品市场，促进粉葛产业发展。本实验在粉葛发酵工艺研究过程中，仅选用一种益生菌（嗜酸乳杆菌），并未考虑菌种筛选及菌种间复配对发酵结果的影响，可能没有最大程度增加粉葛中活性成分含量。因此，实验后期将对粉葛发酵菌种进行筛选，并进行优势菌种复配实验，选择最优菌种、最佳复配比发酵粉葛，以期更大程度增加粉葛中活性成分含量。
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图 5 接种量、料液比、发酵时间对葛根素含量的响应曲面图及等高线图
Figure 5. Response surface and contour plots of inoculation amount, solid-liquid ratio and fermentation time on puerarin content
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图 7 发酵前、后粉葛中异黄酮类成分HPLC图
注：A.混合标准品；B.发酵前粉葛样品；C.发酵后粉葛样品；1.葛根素；2.大豆苷；3.大豆苷元。
Figure 7. HPLC diagrams of isoflavones in Puerariae thomsonii before and after fermentation
表 1 响应面因素和水平设计
Table 1 Response surface factor and level design
水平 因素 A接种量（%） B料液比（g/mL） C发酵时间（h） −1 4 1:2 24 0 6 1:3 36 1 8 1:4 48 
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表 2 响应面设计及结果
Table 2 Response surface design and result
试验号 A接种量 B料液比 C发酵时间 含量（mg/g） 1 0 1 1 6.21 2 1 1 0 5.85 3 1 0 1 5.64 4 1 −1 0 6.41 5 0 −1 1 7.00 6 0 0 0 8.04 7 0 0 0 7.78 8 1 0 −1 6.57 9 −1 0 1 7.59 10 0 1 −1 6.04 11 0 −1 −1 6.10 12 −1 −1 0 5.90 13 0 0 0 8.40 14 −1 1 0 7.44 15 0 0 0 8.26 16 −1 0 −1 7.91 17 0 0 0 7.71
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表 3 回归模型方差分析表
Table 3 Regression model variance analysis table
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性 模型 12.71 9 1.41 4.83 0.0250 显著 A 2.69 1 2.69 9.19 0.0191 显著 B 0.020 1 0.020 0.068 0.8013 C 4.050×10−3 1 4.050×10−3 0.014 0.9097 AB 0.84 1 0.84 2.86 0.1346 AC 0.093 1 0.093 0.32 0.5905 BC 0.13 1 0.13 0.46 0.5216 A2 1.31 1 1.31 4.47 0.0722 B2 5.55 1 5.55 18.95 0.0033 显著 C2 1.29 1 1.29 4.39 0.0743 残差 2.05 7 0.29 失拟项 1.69 3 0.56 6.37 0.0528 不显著 纯误差 0.35 4 0.089 总离差 14.76 16 注：P<0.05表示具有显著性，P˃0.05表示不具有显著性。
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表 4 发酵前、后粉葛中水分、灰分测定结果（n=3）
Table 4 Determination results of moisture and ash in Pueraria thomsonii before and after fermentation (n=3)
测定项 水分（%） 灰分（%） 发酵前粉葛 9.69±0.01 3.89±0.05 发酵后粉葛 8.19±0.08 4.19±0.03
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表 5 发酵前、后粉葛中异黄酮类成分含量测定结果（n=3）
Table 5 Determination results of isoflavone content in Puerariae thomsonii before and after fermentation (n=3)
测定项 测定成分（mg/g） 大豆苷元 大豆苷 葛根素 总异黄酮 发酵前粉葛 0.22±0.02 0.84±0.02 4.85±0.06 25.68±0.15 发酵后粉葛 0.38±0.02* 1.45±0.03** 8.17±0.02** 33.26±0.34** 注：*表示P<0.05，**表示P<0.01；表6同。
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表 6 粉葛发酵前、后可溶性多糖及淀粉含量测定结果（n=3）
Table 6 Determination results of soluble polysaccharides and starch contents in Puerariae thomsonii before and after fermentation (n=3)
测定项 可溶性多糖（%） 淀粉（%） 直链淀粉 支链淀粉 总淀粉 发酵前粉葛 2.47±0.05 8.28±0.07 − 8.28±0.07 发酵后粉葛 12.6±0.06** 6.44±0.11** 0.98±0.04 7.42±0.07** 注：−表示未检出。
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