High Density Culture Process and Growth Kinetics of Flavor Yeast A10-2
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摘要: 为实现一株自分离风味酵母的高密度培养及生长动力学预测模型构建，本文对从酱油发酵醪中筛选的产4-乙基愈创木酚的风味酵母A10-2进行了高密度培养工艺的研究，对培养基种类（氮、碳源）、浓度进行了研究及优化，并对酵母的生长、基质消耗过程进行了数学模型的构建和验证。结果表明：磷酸二氢铵作为无机氮源，浓度0.2 g/100 mL为最适氮源流加补料方案；使用糖蜜作为唯一碳源时，培养液中持续流加保持总糖浓度为0.4~0.6 g/100 mL可获得最佳菌体生长速度；A10-2酵母的生长符合Logistic方程S形曲线，基质（总糖）消耗符合Leudeking-Priet方程，比生长速率最大值μm为0.4764 h−1，最大菌体生长得率系数YG值为0.5879 g/g，维持系数ms=0.0127 g·L−1·h−1。所建立模型能够较好的描述酵母在高密度培养过程中的生长和耗糖情况，具有预测指导意义。Abstract: In order to realize the high-density culture and establish the predictive growth kinetics model of a self-isolated flavor yeast, the high-density culture process was studied of 4-ethyl-2-methoxyphenol producing yeast A10-2, which screened from soy sauce fermentation mash. The type of culture medium (nitrogen and carbon source) and concentration were studied and optimized. The growth kinetics and the substrate (total sugar) consumption models were established and verified. The results showed that (NH4) H2PO4 fed to make the concentration of culture medium 0.2 g/100 mL was the best inorganic source of nitrogen. To obtain the best cell growth rate, molasses as the only source of carbon, should be fed which controlled the concentration of total sugar in the culture medium to 0.4~0.6 g/100 mL. The growth of A10-2 yeast followed the S-shaped curve of a Logistic model, and the substrate (total sugar) consumption followed the Leudeking-Priet equation. The maximum obtained biomass specific growth rate μm was 0.4764 h−1, while the maximum biomass growth yield coefficient YG was 0.5879 g/g. The maintenance coefficient was 0.0127 g·L−1·h−1. The established models could better describe the growth and sugar consumption of yeast in the process of high-density culture, and have predictive significance.
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调味品是现代生活的必需品。研究表明发酵类调味品在酿造过程中产生的风味物质已知有300余种[1-2]，其风味的形成是多菌种相互作用的结果，如米曲霉、乳酸菌及酵母菌等。其中酵母菌在发酵过程中主要产生的酯类、醇类等物质，对酱料风味的形成具有十分重要的贡献[3]。在发酵特定阶段接种选育的耐盐产香酵母，使其在发酵过程中合成及积累特征性风味物质，如苯乙醇、呋喃酮、4-乙基愈创木酚等，可合理改善及优化酱料风味协调性及提升最终感官指标[4-5]。近年来，充分发挥酵母菌在酱醪中的生香作用，是国内外酱料生产企业所重点关注的研究内容[6]，而目前对人为筛选获得可应用于酱料的风味酵母的高密度培养工艺及生长动力学的研究较少，对其高密度批量培养工艺的研究及实现是其可应用化的前提。
高密度培养指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态的培养技术[7]。流加补料工艺在高密度培养技术广泛应用：通过流加工艺进行培养基限制性底物的不间断补充，如碳、氮源，确保菌体维持高速生长、繁殖，而最终得到高浓度菌体的培养液，有效节省培养容器体积及培养基的消耗，降低生产周期及成本[8]。因此，研究风味酵母的高密度培养工艺及优化是具有实践意义的。生长动力学将培养过程中菌体繁殖、基质消耗、产物生成有关的因素用一定形式的数学模型进行表达和定量描述[9-11]。在酱料风味调控技术中，酱醪中产香酵母的筛选、驯化及繁殖应用是非常关键的环节，建立目标酵母的生长动力学模型，将为风味酵母的高密度产业化培养提供理论及实践指导基础[12]。，
本文通过对酱醪中筛选的风味酵母A10-2的高密度流加分批补料工艺进行研究，对培养基质氮源、碳源优化，生长动力学、基质消耗动力学进行参数探索及模型构建，分析其生长及基质消耗的动态平衡形成条件以及内在规律，以获得培养的最大菌体干重浓度以及最短培养时间。同时，根据生长动力学模型对目标酵母培养条件进行分析，评价所建生长动力学预测模型的有效性，为设计合理的风味酵母高密度流加补料培养工艺及酵母生长指标的预测提供理论指导依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
菌株 由李锦记（新会）食品有限公司酱油醪筛选所得，经分析为高产4-乙基愈创木酚的风味酵母，初步鉴定为Wickerhamiella versatilis，命名为A10-2[13]；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、MgSO4·7H2O、NH4H2PO4、（NH4）2HPO4、CH4N2O、NH4Cl等 均为国产分析纯；维生素B1、维生素B5、维生素B6、生物素 均为阿拉丁纯品；糖蜜 广西陆屋欧亚糖业有限公司。
30 L自吸式发酵罐 南京天汇生物技术装备有限公司；BlueStar B紫外可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器股份有限公司；H2050R离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；MS3002TS/02电子秤 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；794自动点位滴定仪 瑞士万通公司；ZWY-211C摇床 上海智城分析仪器制造有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基制备
种子液培养基：酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L。
发酵培养基配方：维生素B1 20 mg/L, 维生素B6 20 mg/L，维生素B5 20 mg/L，生物素10 mg/L，MgSO4·7H2O 30 mg/L，KH2PO4 0.1 g/L。酸化糖蜜作为培养基碳源根据其总糖含量添加，控制培养液总糖浓度为10 g/L。
pH调节剂：10% H2SO4，10% Na2CO3。
流加补料液配方：碳源为酸化糖蜜（50°Brix；硫酸调节pH至4.3，4 h后调整pH至5.3），氮源按单因素实验优选氮源配成，磷源为10% KH2PO4。
单因素实验筛选培养基：在发酵培养基配方基础上去除碳源与氮源，加入所需筛选因素配成。
1.2.2 种子液培养
取新鲜斜面菌种接种至灭菌（121 ℃，15 min）后装有100 mL种子液培养基的250 mL摇瓶中，在30 ℃、180 r/min条件下摇床培养24 h。
1.2.3 氮源单因素实验设计
使用发酵培养基，添加酸化糖蜜至培养液中总糖浓度为20 g/L。分别使用磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、尿素、氯化铵作为氮源变量，配制不同浓度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/100 mL）培养基各100 mL于250 mL三角瓶中，分别接种斜面新鲜菌种，于30 ℃、180 r/min条件下摇床培养，48 h后测定OD600 nm值。
1.2.4 发酵罐补料流加高密度培养
将20 L发酵培养基加入发酵罐（最大装液量30 L），实消后取液体菌种按10%接种量接种至发酵培养基中，使用自吸式发酵罐进行酵母高密度培养，培养过程控制溶氧大于30%，pH4.8~5.3，温度（30±0.3） ℃。每2 h测定菌体干重浓度，对数期增长后菌体干重浓度不再升高定义为培养终止状态。酸化糖蜜作为碳源，选择单因素实验优选氮源进行流加补料，根据《酵母生产与应用手册》，流加糖液速度符合函数关系式[14]：
F=µV0X0Yx/s(SF−S)eµt (1) 式中：V0表示初始培养液体积，L；X0表示初始菌体干重浓度，g/L；μ表示设定比生长速度（根据定期菌体干重浓度变化进行计算及调整），h−1；Yx/s表示菌体对基质（总糖）得率，g菌体干重/g基质；F表示浓基质（糖液）的流加速度，L/h； SF表示浓基质浓度，g/L；S表示培养液中基质浓度，g/L；t表示培养时间，h。
1.2.5 高密度培养过程流加工艺碳源最适浓度的研究
多批次补料流加培养菌体，调整碳源（酸化糖蜜）泵入流速，通过持续流加糖液保持培养液总糖浓度不同批次分别为0~0.2、0.2~0.4、0.4~0.6、0.6~0.8、0.8~1.0、1.0~1.2、1.2~1.4 g/100 mL，根据培养终酵母干重浓度与培养时间，对比不同批次发酵培养液中不同碳源（总糖）浓度对菌体干重平均生长速度的影响。
1.2.6 高密度培养菌体生长动力学模型建立
流加补料高密度培养，培养过程中每2 h进行取样，检测菌体干重。根据菌体生长情况，以进入对数生长时期的时间为起点，取样时间缩短为每0.5 h，同时检测总糖含量、菌体干重，计算进入对数生长时期后单位体积菌体生长所需的总糖耗用量。通过研究高密度培养过程中菌种干重与时间及基质（总糖）消耗的对应关系，建立生长动力学、基质消耗动力学模型。
1.2.6.1 菌体生长动力学模型的建立
Logistic 方程是用来描述培养过程中菌体生长随时间变化规律最常用的模型，是典型的“S”形曲线，选择使用Logistic方程建立酵母A10-2的生长动力学，菌体生长模型的微积分表达式如公式（2）所示[15]：
dXdt=µm(1−XXm)X (2) 对式（2）进行积分后得到：
X=X0XmeµmtXm−X0+x0eµmt (3) 式中：X0表示菌体初始浓度，g/L；X表示菌种浓度，g/L；Xm表示菌种浓度，g/L；μm 表示最大比生长速率，h−1；t表示发酵时间，h。
1.2.6.2 菌体底物消耗动力学模型的建立
由物料恒算可知，限制性底物的消耗用于菌体生长、菌体维持和产物合成这3 个方面[16]。对于限制性底物的消耗一般采用类似Luedeking-Piret方程[17-18]来描述：
−dSdt=dXYx/s+dPYp/sdt+msX (4) 由于培养过程中尽可能地抑制菌体代谢，其代谢产物所耗用的基质则微乎其微。忽略菌体代谢产物所耗用的碳源后：
−dSdt=dXYx/s+msX (5) 比底物消耗速率方程为：
qs=µYx/s+ms (6) 将式（5）微积分后得：
S=S0−X0XmeµmtYx/s(Xm−X0+X0eµmt)+X0Yx/s−Xmmsµmln(Xm−X0+X0eµmtXm) (7) 式中：X表示菌体干质量浓度，g·L−1；P表示产物浓度，g·L−1；Yx/s表示菌体对基质（总糖）得率，g菌体干质量/g基质；Yp/s表示产物对基质得率，g产物/g基质；ms表示维持系数，g·L−1·h−1；qs=dS/Xdt，底物比消耗速率，g·g−1·h−1； μ=dX/Xdt比生长速率，h−1；t表示培养时间，h。
1.2.7 分析检测
菌体干重测定：准确量取100 mL培养液，离心10 min（4000 r/min），弃上清液。加100 mL蒸馏水洗涤，再次离心10 min，弃上清液后以蒸馏水将菌种打散洗出至培养皿，置于烘箱中105 ℃至恒重后进行测定[19]。
总糖测定：采用酸水解法，使用3，5-二硝基水杨酸进行测定[20]。
1.3 数据处理
采用Excel 2019软件对3次重复数据进行统计分析并作图，取平均值作为拟合数据。使用SAAinc-Elisa软件对数据进行拟合。
2. 结果与分析
2.1 碳、氮源优选实验
2.1.1 氮源优选单因素实验
糖蜜中含有少量氮源，甘蔗糖蜜中总氮含量约为0.6%（质量比），其中大部分以生物碱及胺态氮形式存在[21-22]。流加补料高密度培养工艺中，糖蜜所带入培养液的总氮不足0.1 g/L，远不足以支持酵母的增殖。为解决氮源缺乏而导致的增长迟缓问题，需通过外加氮源进行补充。菌体对有机氮源的利用优于无机氮源，但批量生产中，使用无机氮源更符合对成本的控制需求[23]。
使用摇瓶法进行氮源优选实验，因单次培养基投入摇瓶培养而收获菌体浓度小，为避免低浓度时检测菌体干重的误差，使用OD600 nm检测值作为干重浓度的反馈。根据检测数据及统计分析，在不同氮源条件下，如图1~图4所示，氮源浓度在0.05~0.2 g/100 mL时，各实验组均呈现了菌体吸光度随氮源浓度增加而增大的趋势；在氮源浓度大于0.2 g/100 mL时，菌体吸光度随氮源浓度增加而减少。结果表明，氮源浓度在0.05~0.3 g/100 mL范围内，尿素与磷酸氢二铵对酵母菌体培养效果无显著差异（P>0.05），磷酸二氢铵作为氮源的培养效果最佳，氯化铵作为氮源时培养效果较差。在氮源浓度0.2 g/100 mL情况下，磷酸二氢铵作为氮源得到吸光度最大（P<0.05），即反馈菌体干重浓度最大。
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图 1 不同浓度尿素（氮源）对培养终酵母浓度的影响Figure 1. Effects of different concentration of CH4N2O as nitrogen on the maximum density of yeast![]()
图 2 不同浓度磷酸二氢铵（氮源）对培养终酵母浓度的影响Figure 2. Effects of different concentration of NH4H2PO4 as nitrogen on the maximum density of yeast![]()
图 3 不同浓度磷酸氢二铵（氮源）对培养终酵母浓度的影响Figure 3. Effects of different concentration of （NH4）2HPO4 as nitrogen on the maximum density of yeast![]()
图 4 不同浓度氯化铵（氮源）对培养终酵母浓度的影响Figure 4. Effects of different concentration of NH4Cl as nitrogen on the maximum density of yeast2.1.2 高密度培养过程流加工艺碳源最适浓度的研究
糖蜜中含有大量的蔗糖和转化糖，根据研究，甘蔗糖蜜中总糖占比约50% （糖蜜固形物80°Brix~85°Brix），其中非发酵性糖仅占总糖含量的10%左右[24]。除碳源、氮源外，糖蜜中还含有钾、钙、磷、硫及维生素等微量元素，亦能促进酵母菌体的增长[25]。使用糖蜜作为高密度培养过程的唯一碳源，是满足菌体所需且成本低廉、培养效果较好的原料。影响高密度培养的因素有很多，如温度、pH、菌体活性等，而基质浓度则是流加补料高密度培养工艺影响酵母干重得率的关键因素之一[26-27]。
流加补料过程中，通过调整碳源泵入速度以维持培养液中总糖浓度在设定范围内。根据实验结果，培养液总糖浓度不同，则酵母增长的平均生长速度（培养终状态酵母干重浓度/培养总耗时）也有较大差异。如图5所示，当培养过程中培养液总糖浓度始终维持在0~0.6 g/100 mL时，酵母干重平均增长速度随总糖浓度增大而增大。当总糖浓度超过0.6 g/100 mL，酵母干重平均增长速度随总糖浓度增加而减小。在培养液总糖浓度控制在0.4~0.6 g/100 mL时，其干重平均增长速度达到最大。酵母的生长与代谢取决于很多因素，如氧、基质、生长周期等。根据研究，酵母具有“Crabtree效应”（又称“葡萄糖效应”），当培养液含糖量过高时，即使在氧充足的情况下，酵母也会进行酒精发酵而减少糖的利用率，致使自身细胞增长速度降低[28-29]。而根据实验结果，在培养液总糖浓度大于0.6 g/100 mL时，单位体积酵母的干重增长速度显著降低亦印证了此效应。
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图 5 培养液不同总糖浓度对菌体干重的影响注：相同字母表示差异不显著（P>0.05），不同字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 5. Effects of different concentrations of total sugar in culture medium on yeast cell dry weight2.2 菌体动力学模型建立
2.2.1 菌体生长动力学模型建立
现代微生物动力学理论起源于Monod方程，作为描述菌体生长的模型，被认为更适合菌体生长较慢、密度较低且无抑制作用的环境，反馈了菌体增长与基质消耗的μ=μ（S）情况[30]。尝试使用Monod模型对A10-2酵母培养阶段各数据进行拟合，以1/S为横坐标，1/μ为纵坐标作图，所得结果拟合决定系数并不高（R2=0.807）。Monod模型在补料流加高密度培养工艺中，无法描述菌体密度对自身的抑制，且流加基质的补充亦降低了基质对菌体的限制性影响，拟合系数相对较低亦佐证了此理论。Logistic方程能够很好的诠释分批发酵过程中菌体浓度增加对自身的抑制而呈现S形生长曲线[31]。因此，选择使用Logistic方程更适用于描述产香酵母的生长。
如图6所示，使用酵母高密度培养过程中干重与时间数据作图，根据Logistic模型进行数据分析，并运用SAAinc-Elisa软件对实验值进行非线性拟合，得到拟合公式中μm值为0.4764 h−1。将动力学参数X0=1.73 g/L、Xm=36.09 g/L、μm=0.4764 h−1 代入式（3）中，可得到菌体生长动力学方程：
X=62.43e0.4764t34.36+1.73e0.4764t 拟合决定系数R²=0.9721，验证了Logistic方程能够很好地描述产香酵母A10-2分批高密度培养过程中菌体的生长情况。
在高密度培养过程中，流加补料使培养液总体积增大。但由于A10-2酵母的迟缓期时间较长（约20 h），而对数期时间较短（8~10 h），补料流加时浓糖液产生的稀释率对发酵液整体体积的影响较小（耗用糖液体积:培养液终体积=1:8.5）。由此认为取样间隔时间为2 h或更短的情况下，可忽略流加造成的体积变化，此动力学方程对实际生产是具有预测指导意义的。
2.2.2 菌体底物消耗模型建立
选用类似Luedeking-Piret方程建立菌体总糖消耗模型，如图7所示，根据式（5）比底物消耗速率方程将μ对比底物消耗速率qs作图，并进行线性回归：
得到拟合方程中Yx/s最大值YG=0.5879 g/g，ms=0.0127 g·L−1·h−1。将YG、ms及生长动力学所得X方程代入式（6）得：
S=S0−106.19e0.4764t34.36+1.73e0.4764t+2.94−0.96ln34.36+1.73e0.4764t36.09 对于流加补料高密度培养工艺，溶液中糖液的持续补充使公式中的S0无法赋予定值计算，而单位体积内总糖的累加消耗量可通过上式变形得到：
St=S0−S=0.96ln34.36+1.73e0.4764t36.09+106.19e0.4764t34.36+1.73e0.4764t−2.94 该方程描述了高密度培养过程中单位体积培养液中总糖的累加消耗情况，相关系数R2=0.9767说明了模型拟合度高，方程建立较理想。
2.2.3 模型验证
为检测模型的误差及验证模型的准确性，重复实验并测定、计算菌体干重数据及单位体积总糖累加消耗数据，使用实验实际值与拟合公式计算值进行对比，计算绝对误差（表1）。
表 1 A10-2酵母高密度培养动力学数据拟合值与实验值对比Table 1. Comparison of growth kinetics of A10-2 yeast between calculated and experimental data时间（h） 菌体干重 单位体积总糖耗用量 拟合值（g/L） 实验值（g/L） 绝对误差 （%） 拟合值（g/L） 实验值（g/L） 绝对误差（%） 23 6.84 6.41 6.71 66.02 65.12 1.39 25 13.76 12.86 7.00 66.94 67.38 0.64 27 22.56 23.28 3.10 67.86 68.93 1.54 29 29.94 30.12 0.61 68.78 69.72 1.34 31 34.26 33.87 1.16 69.70 71.19 2.09 33 36.28 35.32 2.71 70.61 74.63 5.38 35 37.13 35.93 3.33 71.53 76.34 6.30 由于菌体适应期（0~22 h）生长缓慢且生物量受接种初期影响较大，为排除操作性影响而取菌种进入对数期后数据进行研究。数据表明，菌体干重与单位体积总糖耗用量实验数据与拟合计算数据的绝对误差均小于10%，认为所建立菌体生长动力学模型与底物（总糖）消耗模型可较好地描述A10-2酵母高密度流加补料工艺的生长与总糖利用情况[32]，模型准确性较高，能够为实际培养过程提供理论参考。
3. 结论
本文对可应用于酱料增香的风味酵母进行高密度培养补料碳、氮源的优化，以成本控制为前提有效获得了最佳补料方案：磷酸二氢铵作为氮源，0.2 g/100 mL为优选浓度；糖蜜作为碳源流加补充，培养基中总糖流加保持0.4~0.6 g/100 mL浓度可获得较高的培养终菌体干重收获率。另外，本文也探索了高密度培养过程风味酵母的生长动力学及基质消耗动力学，对其模型的建立将为培养的预测性及可控性提供理论指导依据。
后续研究将围绕放大生产批量高密度培养工艺进行参数差异的探究及准确性调整，从而建立以高菌体干重收获率为目的的风味酵母A10-2高密度补料流加工艺，并根据动力学模型对其进行预测及培养控制。风味酵母高密度批量生产的实现及调控，将对其在酱料中的有效应用及风味强化技术起到辅助性推动作用。
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图 1 不同浓度尿素（氮源）对培养终酵母浓度的影响
Figure 1. Effects of different concentration of CH4N2O as nitrogen on the maximum density of yeast
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图 2 不同浓度磷酸二氢铵（氮源）对培养终酵母浓度的影响
Figure 2. Effects of different concentration of NH4H2PO4 as nitrogen on the maximum density of yeast
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图 3 不同浓度磷酸氢二铵（氮源）对培养终酵母浓度的影响
Figure 3. Effects of different concentration of （NH4）2HPO4 as nitrogen on the maximum density of yeast
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图 4 不同浓度氯化铵（氮源）对培养终酵母浓度的影响
Figure 4. Effects of different concentration of NH4Cl as nitrogen on the maximum density of yeast
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图 5 培养液不同总糖浓度对菌体干重的影响
注：相同字母表示差异不显著（P>0.05），不同字母表示差异显著（P<0.05）。
Figure 5. Effects of different concentrations of total sugar in culture medium on yeast cell dry weight
表 1 A10-2酵母高密度培养动力学数据拟合值与实验值对比
Table 1 Comparison of growth kinetics of A10-2 yeast between calculated and experimental data
时间（h） 菌体干重 单位体积总糖耗用量 拟合值（g/L） 实验值（g/L） 绝对误差 （%） 拟合值（g/L） 实验值（g/L） 绝对误差（%） 23 6.84 6.41 6.71 66.02 65.12 1.39 25 13.76 12.86 7.00 66.94 67.38 0.64 27 22.56 23.28 3.10 67.86 68.93 1.54 29 29.94 30.12 0.61 68.78 69.72 1.34 31 34.26 33.87 1.16 69.70 71.19 2.09 33 36.28 35.32 2.71 70.61 74.63 5.38 35 37.13 35.93 3.33 71.53 76.34 6.30 
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